Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně Miroslav Votava RŮST A MNOŽENÍ BAKTERIÍ Třetí přednáška pro II. r. VL 10.3.2016

Velikost bakterií – opakování Patogenní: většinou kolem 1–5 μm (1 μm = 10-3 mm) Stafylokok: průměr kolem 1 μm Poměrně velké: rody Bacillus a Clostridium (robustní tyčinky kolem 10 × 1–2 μm) Poměrně dlouhé: staré kultury většiny tyčinek (vlákna až 50 μm dlouhá) Poměrně malé: rod Haemophilus (ve sputu kolem 0,3 × 0,6 μm ) Ještě menší: rickettsie (kolem 0,5 μm) chlamydie (elementární tělíska cca 0,3 μm ) mykoplasmata (kolem 0,2–0,25 μm )

Bakteriální stěna – opakování G+ kyselina G– lipoteichoová O-antigen lipopoly- vnitřní polysacharid sacharid lipid A (endotoxin) murein porin vnější membrána lipoprotein periplasmatický prostor vnitřní membrána cytoplasmatická membrána G+ G–

Podstata grampozitivity – opakování Je záhadou – souvisí ale se stavbou stěny Jedna teorie: Silná vrstva peptidoglykanu se po alkoholu smrští a zpomalí vyplavování komplexu krystalové violeti s jodem z G+ buněk Druhá teorie: Ve stěně G– bakterií je více lipidů, proto v ní alkohol vytváří póry, jimiž se barevný komplex snáz vyplavuje

Příklady G+ a G– mikrobů – opakování grampozitivní Staphylococcus Streptococcus Bacillus Lactobacillus Clostridium Listeria Corynebacterium kvasinky a plísně gramnegativní Escherichia Salmonella Vibrio Haemophilus Pseudomonas všechny spirálovité Mycoplasma rickettsie a chlamydie

Citlivost na antibiotika – opakování Účinek hlavně na grampozitivní penicilin oxacilin makrolidy (erytromycin) linkosamidy (linkomycin) glykopeptidy (vankomycin) Účinek hlavně na gramnegativní aminoglykosidy (gentamicin) fluorochinolony (ciprofloxacin) polypeptidy (colistin) cefalosporiny III. gen. (ceftriaxon)

Odolnost vůči zevním vlivům – opakování grampozitivní Snášejí dobře vysychání a vyšší koncentraci solí → proto je nacházíme: na kůži (stafylokoky, propionibakteria) v půdě (klostridia, bacily, nokardie, plísně) gramnegativní Snášejí dobře vliv toxických látek a extrémů pH → proto je nacházíme: převážně ve vlhku (enterobakterie, pseudomonády, jiné nefermentující tyčinky, vibria)

Růstový cyklus bakterií Bakterie se množí růstovým cyklem, ten zahrnuje tyto procesy: Perioda I (iniciační): buňka roste a hromadí se v ní proteiny spouštějící další krok Perioda C (replikace chromosomu): z jednoho místa se rozbíhá oběma směry proti sobě Perioda D (dělení): vytvoří se zásoba makromolekul cytoplazmatická membrána se vmezeří mezi replikované chromosomy a oddělí je buněčná stěna v určitém místě vrůstá do buňky a tvoří tzv. septum, které nakonec buňku rozdělí

Dělení bakteriální buňky pouzdro cytoplasmatická membrána bakteriální stěna fimbrie nukleoid ribosomy plasmidy granula vakuola bičík septum

Dělení a uspořádání bakterií – I Koky, v jedné rovině: streptokoky řetízky Koky, v různých rovinách: stafylokoky shluky Koky, ve dvou na sebe kolmých rovinách: mikrokoky tetrády

Dělení a uspořádání bakterií – II Tyčinky, příčné dělení: většina řetízek tyčinek Tyčinky, podélné dělení: např. mykobakteria korynebakteria palisádovité uspořádání

Generační doba Generační doba = délka růstového cyklu = = doba zdvojení = doba, za niž se počet bakterií zdvojnásobí Generační doba bakterií: v průměru cca 30 min krátká: Escherichia coli za ideálních podmínek 20 min dlouhá: Mycobacterium tuberculosis přibližně 12 hodin Protože během každé generační doby se počet bakterií zdvojnásobí, bakterie se množí geometrickou řadou

Geometrická řada – I Počet bakterií při generační době 0,5 hod čas (hod) počet 20=1 4 28=256 0,5 21=2 4,5 29=512 1 22=4 5 210=1024 1,5 23=8 5,5 211=2048 2 24=16 6 212=4096 2,5 25=32 12 224 ≈ 107 3 26=64 18 236 ≈ 1011 3,5 27=128 24 248 ≈ 1014

Geometrická řada – II Tedy: je-li generační doba 30 min, pak za 24 hodin vznikne z jedné buňky teoreticky 248 = 2,8.1014 buněk, prakticky o 5 řádů méně (tj. asi 109 buněk) 109 bakterií je takové kvantum, že musí být vidět i při pozorování pouhým okem: tekutá půda (bujon) se zakalí nebo se v ní objeví sediment nebo blanka na pevné půdě (agar) vyroste bakteriální kolonie

Co je bakteriální kolonie? Bakteriální kolonie = útvar na povrchu agaru, obsahující těsně na sebe naléhajících cca 109 buněk živých a cca 105 buněk již odumřelých Vzhled kolonie závisí mimo jiné na druhu mikroba (např. na velikosti jeho buněk) druhu kultivační půdy (např. na množství živin) vzdálenosti od sousedních kolonií (čím je kolonie izolovanější, tím je větší a typičtější)

Vlastnosti bakteriální kolonie Na bakteriální kolonii lze rozeznávat až 10 znaků: 1. Velikost – obvykle kolem 1-2 mm 2. Tvar – kulatý, oválný, nepravidelný, laločnatý aj. 3. Profil – plochý, vypouklý, miskovitý aj. 4. Okraje – rovné, vláknité, s výběžky, s lalůčky aj. 5. Povrch – hladký a lesklý, matný, drsný, krabatý 6. Transparenci – průhledná, průsvitná, neprůsvitná 7. Barvu – bezbarvá, pigmentovaná (nažloutlá aj.) 8. Změny v okolí – zbarvení, hemolýza, precipitát 9. Konzistenci – mazlavá, drobivá, mukózní, vrostlá 10. Zápach – po jasmínu, spermatu, ovoci aj.

Geometrická řada – III Důsledky při kvantitativním vyšetřování moči: Ze zevního ústí močové roury se do moči mohou spláchnout bakterie až do koncentrace 103/ml Jde o pouhou kontaminaci, která nemusí mít nic společného s cystitidou V 1 μl této moči (vzorek se očkuje 1μl kličkou) bude 1 bakterie (1 CFU = 1 colony-forming unit) → z 1 μl vyroste 1 kolonie Výsledek vyšetření: 103 CFU/ml = pravděpodobně kontaminace To platí, jen když se moč zpracuje okamžitě Ale co když bude vzorek moči v parném létě několik hodin na cestě do laboratoře?

Geometrická řada – IV Moč je dobrým kultivačním médiem, bakterie se v ní množí i během transportu Při generační době 30 min: za 2 hodiny → z 1000 bakterií bude 16 000 bakterií, z 1 μl moči vyroste 16 kolonií Výsledek: 104 CFU/ml = suspektní nález za 4 hodiny → z 1000 bakterií bude 256 000 bakterií, z 1 μl moči vyroste 256 kolonií >105 CFU/ml = pozitivní nález (ovšem falešně +!) moč se musí zpracovat do 2 hodin po odběru nebo uložit v chladničce při 4 °C

Růstová křivka – I Výsledek 109 buněk/24 hod z původně jediné platí pro stacionární kulturu, v níž se spotřebovávají živiny a přibývá zplodin metabolismu rychlost množení se mění v závislosti na čase ve stacionární kultuře existují růstové fáze, které se dají vyjádřit růstovou křivkou

Růstová křivka – II Růstová křivka znázorňuje počet živých buněk v závislosti na stáří kultury, a to v logaritmické stupnici Růstová křivka zachycuje 4 růstové fáze: fáze prodlevy (lag-fáze) fáze logaritmická (exponenciální) fáze stacionární fáze odumírání Mezi fázemi jsou pozvolné přechody

Růstová křivka stacionární kultury Růstová křivka – III Růstová křivka stacionární kultury stacionární fáze 10 8 (exponenciální) logaritmická fáze 6 log10 počtu živých buněk fáze odumírání 4 2 lag-fáze cca 24 hod čas

Co je logaritmus? V rovnici 103 = 1000 je desítka (10) základ, trojka (3) exponent Tento exponent (3) = logaritmus čísla 1000 (při základu 10) Logaritmy při základu 10 = dekadické logaritmy Obecně: Dekadický logaritmus čísla a je exponent, kterým je nutno umocnit číslo 10, abychom dostali číslo a

Růstová křivka stacionární kultury Růstová křivka – III Růstová křivka stacionární kultury stacionární fáze 10 8 (exponenciální) logaritmická fáze 6 log10 počtu živých buněk fáze odumírání 4 2 lag-fáze cca 24 hod čas

Růstová křivka – IV lag-fáze (fáze prodlevy): buňky se nedělí, jen se zvětšují logaritmická fáze: buňky se dělí stálou rychlostí (generační doba je stále stejná); vztah mezi počtem živých buněk a časem je exponenciální stacionární fáze: počet buněk se nemění fáze odumírání: alespoň zpočátku probíhá též podle exponenciální křivky

Kontinuální kultivace – I Součást bioinženýrství (biotechnologie) Princip: Do kultury se průběžně přivádějí živiny a odstraňují se z ní zplodiny metabolismu včetně namnožených buněk Kultivačním nádobám se říká bioreaktory (fermentory) Celý proces bývá automatizován

Kontinuální kultivace – II Původně záležitost hlavně čs. vědců Světově uznávaným klasikem kontinuální kultivace byl akademik Ivan Málek (1909-1990), až do normalizace ředitel Mikrobiologického ústavu ČSAV Využití kontinuální kultivace a fermentace: v průmyslu k výrobě mikrobiální hmoty (kvasnice), ale hlavně k výrobě rozmanitých látek (organické kyseliny, antibiotika, enzymy, vitaminy apod.)

Doporučená literatura Paul de Kruif: Lovci mikrobů Paul de Kruif: Bojovníci se smrtí Alarich: Medicina v županu Prosím o příklady další beletrie v souvislosti s medicínou vůbec a s mikrobiologií zvlášť. Tyto příklady, vtipy a případné dotazy zasílejte na adresu mvotava@med.muni.cz Děkuji, že jste mne sledovali