KLINICKÁ MYKOLOGIE Lékařská mikrobiologie – cvičení, jarní semestr 2016 Mikrobiologický ústav LF MU www.mycology.uni-bayreuth.de

Osnova Obecné vlastnosti mikromycet Morfologie a fyziologie mikromycet Mykotická onemocnění Diagnostika mykóz

Obecné vlastnosti mikromycet Eukaryotní organismy (x bakterie prokaryota). Buněčná stěna tvořena složitými polysacharidy – nejčastěji mannany, chitin, chitosan (odlišná stavba od BS bakterií). Plazmatická membrána – steroidní látky: ergosterol (u člověka cholesterol). Gramem se barví jako G+, tedy fialově. Agens zdlouhavých, obtížně léčitelných infekcí. Léčba antimykotiky (x bakterie antibiotika).

Buněčná stěna mikromycet

Morfologie mikromycet (1) Buňky hub se vyskytují v různých morfologických uspořádáních: Blastokonidie – oválný nebo kulatý tvar, charakteristický tvar kvasinek. Pučící blastokonidie = blastospory. Pseudohyfa – vláknitý útvar připomínající hyfu, je tvořen pouhým zřetězením buněk Hyfa – vlákno buněk, může být větvené, se septy či bez nich Pseudomycelium – soubor pseudohyf Mycelium – soubor hyf, může být vegetativní (kotví houbu v substrátu) a generativní (nese rozmnožovací struktury houby)

Morfologie mikromycet (2)

Rozmnožování mikromycet (1) Pohlavní i nepohlavní. Pohlavní pomocí spor: askospory(váček se sudým počtem pohlavních buněk) oospory (vznik splynutím velké samičí buňky a malé samčí buňky) zygospory (splynutím dvou stejně velkých pohlavních buněk opačného pohlaví spájení hyf (zvláštní typ, přiložení samčího a samičího vlákna vznik můstku výměna genů)

Rozmnožování mikromycet (2) Pohlavní i nepohlavní. Nepohlavní pomocí konidií (převládá). arthrokonidie (oddělování koncových částí hyf blastokonidie (oválné či kulaté buňky na koncích pseudohyf) chlamydokonidie (silnostěnné útvary kdekoli v průběhu či na konci hyf nebo pseudohyf) mikroskonidie (oválná, kulovitá či hruškovitá tělíska rozmístěná jednotlivě nebo ve svazečcích kdekoliv v průběhu hyf) sporangiokonidie (konidie v pouzdře) makrokonidie (konidie v pouzdře s přepážkami)

Stavba těla hub

Klasifikace mikromycet dle morfologie kvasinkovité mikromycety Blastokonidie (někdy pseudohyfy, chlamydokonidie) Candida sp., Cryptococcus neoformans, Malassezia furfur, Rhodotorula rubra, Saccharomyces cerevisiae, Pneumocystis jiroveci, ... dimorfní mikromycety za nižní teploty (do 30 °C) rostou ve vláknité formě, při 35–37 °C kvasinkovitá forma Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitis, ... vláknité mikromycety Aspergillus sp., Penicilium sp., Rhizopus sp., Mucor sp., Epidermophyton sp., ...

Fyziologie mikromycet Většinou pomalejší růst a množení než u bakterií. Rostou i na chudých půdách. Nejběžnější je Sabouradův agar s 2 – 4 % glukózy s přídavkem ATB (nejčastěji chloamfenikol nebo amikacin+vankomycin pro potlačení růstu bakterií). Kultivace většinou při 30 °C (bakterie většinou při 37 °C). U dimorfních hub častá souběžná kultivace při 22 °C a 37 °C. Bohatá biochemická aktivita: Auxanogram (asimilace různých látek) Zymogram (štěpení cukrů) Mnoho antigenních struktur pro přímou diagnostiku.

Onemocnění způsobená houbami Mikroskopické houby: Mykózy – zánětlivá onemocnění způsobená houbami. Nejzávažnější, dělíme je na povrchové (superficiální) systémové / orgánové (viscerální). Mykotoxikózy – působení houbových toxinů (alergické reakce, otravy, ...) Mycetismy – mechanické působení v těle, rostoucí houba utlačuje okolní tkáně (Makroskopické houby – otravy)

Povrchové mykózy (1) Nejčastěji kožní mykózy (=dermatomykózy, nejde pouze o infekce kůže, ale také nehtů, vlasových váčků atd.) Způsobeny dermatofyty: rody Trichophyton, Epidermophyton a Microsporum. Přenos: antropofilní (přenos mezi lidmi), zoofilní (ze zvířat) a geofilní (z prostředí) Léčba: většinou lokální, dlouhá – masti. Antimykotika: nystatin, klotrimazol, ketokonazol.

Povrchové mykózy (2) www.huidziekten.nl, http://medicalency.com

Systémové mykózy (1) Postihují zpravidla více orgánů či celé tělo (x orgánové – 1 orgán). Většinou vznikají u pacientů s primárním, základním onemocněním (typicky diabetes mellitus, AIDS, transplantace, onkologičtí pacienti...). Nejčastější původci: rody Candida, Penicillium, Aspergillus, Histoplasma, Pneumocystis. Léčba: širokospektrá antimykotika (amfotericin B, vorikonazol, itrakonazol, flucytosin) Komplikace: schopnost tvořit biofilm.

Systémové mykózy (2) Aspergilové infekce Původce: Aspergillus niger (česky kropidlák černý) Onemocnění: časté profesní onemocnění – vlhké, prašné prostředí s neustálým výskytem plísňových spor.

Kandidózy (1) Nejběžnější mykózy, jak povrchové (vaginální, mykózy v ústech = soor, kožní), tak systémové (imunokompromitovaní, častá kolonizace umělých předmětů v těle pacienta). Mnoho faktorů majících vliv na rozvoj kandidózy – stres, hormonální vlivy, věk, strava, hygiena, životní styl, léčba širokospetrými ATB. Vaginální mykózy – jednočetné či recidivující. V případě recidivujících již většinou nedostačuje lokální léčba (novinka: možnost autotransplantace vaginální mikroflóry).

Kandidózy (2) Nejhojněji se vyskytující kandida: Candida albicans (nejen infekční agens, ale také součást běžné mikroflóry – střevní, ústní, u někerých žen vagína). Další zástupci: Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida krusei

Zygomycety Saprofyté, závažné systémové mykózy. Rychlý růst ve stěnách velkých cév, vytvoření tzv. „živého trombu“  až embolie a smrt. Rhinocerebrální (z nosní dutiny do mozku už za několik hodin) a pulmonární zygomykózy, infekce těžkých popálenin, sepse. rody Mucor, Rhizopus, Absidia, ...

Odběr materiálu Krev, hnis, punktáty, sputum, výtěry (systémové mykózy) Šupiny kůže, nehtů, vlasty, chlupy (povrchové mykózy) Doporučena povrchová dezinfekce, poté odběr z okraje ložiska (větší životaschopnost původce). Vlasy a chlupy zasílat i s kořenovými váčky. Z nehtů posílat seškraby nikoliv celé nehty. Nedoporučuje se vkládat do transportních médií (vysoké nároky dermatofytů na kyslík). Kandidy transportní půdy (FungiQuick, C.A.T.).

Diagnostika mykóz (1) Mikroskopie – největší význam: Kultivace Rychlé výsledky v odlišení bakteriální a mykotické infekce. Nativní preparáty (projasnění KOH). Barvené preparáty (Parker inkoust barvící stěny mikromycet tmavě modře až černě, Gram, Giemsa, Rylux – fluorescenční barvení, buněčné stěny září žlutozeleně). Krev, hnis, punktáty, sputum, výtěry (systémové mykózy) Kultivace Přímý průkaz antigenů (mannany) Nepřímý průkaz protilátek (aspergily)

Úkol 1: Mikroskopie kmenů bakterií a kvasinek Obarvěte kmeny Gramem Mikroskopujte pod imerzí Zaznamenejte rozdíly ve velikosti, tvaru, barvě

Úkol 2: Kultivace bakterií a kvasinek (1) Popište kolonie na krevním agaru. Vyhodnoťte růst na Sabouradově agaru s chloramfenikolem. Vyhodnoťte růst na chromogenní půdě (k rozlišení nejdůležitějších zástupců rodu Candida) – využijte kontrolních kmenů. Pozn.: bílé kolonie nelze určit touto chromogenní metodou (není přítomno žádné barvivo).

Úkol 2: Kultivace bakterií a kvasinek (2) Chromogenní půda obsahuje barvivo chromogen (původně bezbarvé) – při odštěpení substrátu dojde ke zbarvení chromogenu charakteristickým zbarvením pro ten který mikroorganismus Na půdě, kterou máme k dispozici: C. albicans – zelenavá C. tropicalis – modrá C. glabrata – hladká růžová C. krusei – drsná růžová

Úkol 2: Kultivace bakterií a kvasinek (3)

Úkol 3: Biochemická identifikace kvasinek soupravou Auxacolor Odečtěte výsledek auxacoloru u kmene, který se nepodařilo identifikovat chromogenní půdou Kromě testů POX a ACT je žlutá pozitivní, modrá negativní Test ACT je žlutá pozitivní, bezbarvá negativní Testu POX je hnědá pozitivní, bezbarvá negativní „V“ = variabilní – může vyjít „+“ i „-“ nepočítá se kód, výsledek se porovnává s tabulkou pokud vyjde více taxonů: C. albicans by byla v úkolu 2c zelená; Rhodotorula by v úkolu 2b měla červený pigment

Úkol 4: Určení citlivosti na antimikrobiální látky Stanovte citlivost na antimykotika a antibiotika Nekultivuje se na MH agaru, ale na Sabouradově! U amfotericinu B je referenční zóna 10 mm (uvnitř zóny nesmí být žádné kolonie) Pro jiná antimykotika je referenční zóna 20 mm (není nezbytné, aby uvnitř zóny nebyly přítomny vůbec žádné kolonie)

Úkol 5: Mikroskopie plísní Nativní preparát, zvětšení objektivu 4×až 40× (bez imerze!) Zakreslete a popište tři druhy mikromycet

Úkol 6: Kultivace plísní Popište vzhled výsledků kultivace Zakreselte tři kmeny ve zkumavkách Některé z mikromycet (zejména dermatofyty), rostou velmi pomalu  nalití Sabouradova agaru do zkumavek, aby nedošlo k vyschnutí Neuplatňuje se biochemické dourčení

Úkol 7: Nepřímá diagnostika aspergilózy Zakreslete výsledek a označte pozitivní a negativní pacienty Mikroprecipitace v agaru dle Ouchterlonyho Do důlku uprostřed je nalita tekutina obsahující antigen Ag difunduje agarem, obsahuje-li sérum Ab, difundují proti němu a na jejich styku vznikne precipitační linie

Úkol 8: Odběr na mykózy Hlavní zásady: nezasílat pouze stěr, nýbrž šupiny z ložiska (stěr by mohl stačit u kandidóz) provést povrchovou desinfekci povrchovou vrstvu neposílat, nýbrž vyhodit a poslat až další vrstvu u plošných ložisek odebírat z okraje (zde je mikromyceta aktivní)

Po tomto cvičení byste měli: Znát hlavní rozdíly mezi buňkou bakterií a mikromycet. Popsat základní morfologické struktury mikromycet. Vědět, jaká onemocnění mikromycety způsobují, jak se odebírá materiál na jejich diagnostiku a jak se tato diagnostika provádí.