Viry a jejich strategie 6.1 Úvod 6.2 Bakteriofág lambda 6.3 Virus chřipky 6.4 HIV

5.1 Úvod - definice viru Virus = buněčný parazit Virion = virus mimo buňky, inertní částice Virion = kapsida (= strukturní protein[y]) + genom + (enzymy) + (membránový obal) Genom = 1 typ NA (DNA nebo RNA), ssNA x dsNA, kružnicový x lineární Virus využívá enzymatického aparátu buňky k reprodukci: A) Nikdy nekóduje vlastní translační aparát B) Nikdy nekóduje enzymy drah energetického metabolizmu Význam virů: nemoci, výzkum buněk, genové inženýrství/terapie

Rozdělení virů 1)Podle hostitele (živočišné, rostlinné, bakteriální) 2)Podle replikační strategie: DNA viry (DNA → DNA): ssDNA, dsDNA RNA viry (RNA → RNA): +RNA, -RNA, dsRNA Retroviry (RNA → DNA → RNA) 3) Obalené x neobalené Evoluční původ virů Nejistý. Dokonce je možný různý původ různých skupin. 1)Redukce buněčných parazitů 2)Buněčné RNA/DNA ("osvobozený plasmid") 3)Katalytické autoreplikující se RNA (relikt RNA světa)

Virová částice Kapsida (kapsomera = strukturní jednotka): 1)ikosaedrální 2)helikální 3)pleiomorfní 4)komplexní Skupiny virů napadající člověka

Interakce viru s hostitelem 1)Vstup do buňky (endocytóza, fúze, poraněná buňka) 2)Lytický cyklus/Chronická infekce/Latence

Virové strategie Vysoká mutabilita (zejména RNA viry) Tlak na malou velikost genomu Nutnost zajistit celý replikační cyklus Využití buněčných struktur Poměrně zajímavé strategie na molekulární úrovni Virové "triky" při translaci

6.2 Bakteriofág lambda Napadá E. coli Ikosahedrální hlavička (2 druhy proteinů) Nekontraktilní ocásek + tenké vlákno na konci Genom: lineární dsDNA (47 kbp), kohezní konce (cos sekvence) Počátek infekce: 1) Adsorbce na buňku (přes malB - transportér maltózy) 2) Cirkularizace genomu (cos místa, buněčná ligáza) 3) Genová exprese (velmi časné a časné geny) 4) Replikace 5) Výběr reprodukční strategie Souvislosti: Genové inženýrství

Dvě různé životní strategie Lytický cyklus: Syntéza virových proteinů Tvorba virových částic Lyze buňky Lysogenie (profág): Integrace do genomu (bakterie se dělí) Stres - aktivace Vystřižení z genomu pak lytický cyklus

Lytická dráha Pokud nemá buňka dostatek živin Zastavení replikačního cyklu (příslušné proteiny nejsou exprimovány) Integrace fágovy DNA do bakteriálního genomu = profág Bakterie s profágem je imunní vůči infekci stejným druhem fága Reaktivace: při poškození DNA (stres), vystřižení λ genomu, lytický cyklus Souvislosti: DNA Lysogenní dráha Pokud má buňka dostatek živin Replikace Vznikají konkatemery - ty se štěpí na jednotlivé genomy O protein = analog DnaA, P protein = analog DnaC Exprese genů pro virovou částici a lyzi buňky

Cro a CI: dva hlavní hráči Cro represor a CI (λ represor): váží specifické DNA sekvence Cro = lytický cyklus, CI = lysogenní cyklus Represorový systém λ fága: CI-OR3-OR2-OR1-Cro (OR - operátor) Vazba CI do OR1 → represe transkripce Cro, vyšší afinita pro vazbu dalšího CI do OR2 Vazba CI do OR2 → represe transkripce Cro Vazba CI do OR3 (pouze vysoké koncentrace CI) → represe transkripce CI Vazba Cro do OR3 → represe transkripce CI Cro represor Promotor P RM Promotor P R

Genová exprese Velmi časné x časné x pozdní lytické x pozdní lysogenní Regulace genové exprese: 1)aktivace iniciace transkripce (CII) 2)represe iniciace transkripce (CI, Cro) 3)antiterminace transkripce (N, Q) 4)antisense RNA (protisměrná transkripce) (anti-Cre, anti-Q) 5) 3´ koncová mRNA degradace (Sib sekvence) PromotorProduktyRegulace iniciaceRegulace terminace PLPL N, CIII, xis-int-sibCIN PRPR Cro, CII, O, P, QCIN PR´PR´lýze, hlava, ocasQ PIPI intCII P RM CICro P AQ anti-Q RNACII P RE anti-Cro RNA, CICII

Genom bakteriofága λ attP = místo integrace Sib = RNA vlásenka signál pro 3´ koncovou degradaci

Integrace do bakteriálního genomu Lysogenie - virus ve formě profága Místně specifická konzervativní rekombinace int = integráza xis = regulátor integrázy Integrací do genomu se přeruší regulační sekvence sib Situace: xis > int (lytický cyklus, sib) nic xis < int (exprese CII - exprese int z P I ): integrace xis = int (reaktivace, není sib): vyštěpení Souvislosti: DNA - Rekombinace

pLpRpR´pIpAQpRMpRE Velmi časné geny CroN Časné geny O P Q CII CIII xis int Represe iniciace Antiterminace Rozhodnutí o lytickém cyklu Buněčné proteázy Sib sekvence: RNáza III degraduje od 3´ konce xis > int, neintegrace head tail lyze Antiterminace Replikace genomu Assembly virionů Lyze buňky Lytická dráha

pLpRpR´pIpAQpRMpRE Velmi časné geny CroN Časné geny O P Q CII CIII xis int Represe iniciace Antiterminace Lysogenní dráha Rozhodnutí o lysogenii aQ a Cro Iniciace transkripce vazba antisense RNA CI int int > xis integrace STOP reprodukce Integrace Exprese pouze CI Represe iniciace

pLpRpR´pIpAQpRMpRE CroN O P Q CII CIII xis int Represe iniciace Antiterminace Reaktivace viru CI DNA poškození SOS response Represe iniciace auto- proteolýza RecA* CI štěpení Excise Lytický cyklus xis = int, excise Chybí sib sekvence Nestabilní při SOS response head tail lyze Antiterminace

*Transdukce Horizontální přenos genetické informace virem 2 možnosti 1) Specializovaná: Po reaktivaci viru (proběhla lysogenie) Chybné vystřižení, okolí inzerce 2) Obecná: Nezávislé na integraci Zabalení buněčné DNA

5.3 Influenza virus Virus chřipky Hostitelé: obratlovci 3 rody: A, B, C (A - pandemie, ptačí chřipka) Genom: [-] RNA, segmentovaný (8 molekul), 13.5 kb Kóduje 10 proteinů Obalený: hemagglutinin (vstup), neuraminidáza (výstup) Obsah virové partikule: genom + replikáza + akcesorické proteiny Mutabilita replikázy (RNA dep. RNA pol.): Buňka nelyzuje, ale stejně umírá (šok) Napadá epithely dých. soustavy Označení kmenů podle typů HA a NA molekul Dnes nejčastější: H1N1, H3N2 Pandemie: H2N2 (?), H1N1, H2N2, H3N2

Proteiny viru chřipky

Replikační cyklus Trvá cca 6 hodin 1) HA - se váže na sialovou kyselinu glykoproteinů epithelu 2) Endocytóza - acidifikace (M2) - fúze membrán - uvolnění viru 3) [-]RNA s proteiny putuje do jádra (výjimka mezi RNA viry) 4) Syntéza [+]RNA vlákna 5) Genová exprese: A) obalové proteiny - sekreční dráha B) replikační proteiny - jádro (NP, PB1, PB2...) C) útok na buňku (NS1, stop translace, protivirová obrana) 6) Shluky HA a NA - assembly genomu + proteinů 7) Pučení viru, odštěpení sialové kyseliny (NA), uvolnění viru

Specifika reprodukce Závislý na buněčné DNA (replikaci) "Dekapitace" buněčných mRNA (PB2) Hlava (+ cca 20 nt) slouží jako primer pro transkriptázu PB1 Dva druhy [+]RNA: mRNA (cap + tail) a cRNA (replikace, neupravené konce) NP reguluje poměr cRNA/mRNA, když ↑NP, ↓mRNA

Replikační cyklus - ilustrace

*Imunizace (očkování) 1)Aktivní imunizace Neinfekční (oslabený vyšlechtěný nebo gen. modifikovaný) patogen 2) Genetická imunizace (nový typ AI) Podání expresního vektoru nesoucího gen pro antigen 3) Pasivní imunizace Podání protilátek (matka/plod, hadí uštknutí) Protilátka (imunoglobulin) = protein produkovaný B lymfocyty Mohutné přestavby genu pro Ig → specifita Vazba antigenu - neutralizace + signál pro další složky IS Genetická imunizace

Interakce s IS hostitele Hemagglutinin a neuraminidáza (povrch) jsou cílem terapie i IS Mutabilita: mění povrchové vlastnosti Antigenní drift: bodová mutace, změna epitopu Antigenní shift: současné napadení buňky 2 kmeny viru, výměna Protilátky proti HA - nejúčinnější Protilátky proti NA - méně učinné Protilátky proti nukleoproteinu - neúčinné

Mezidruhová bariéra Bariéra mezi ptačím a lidským virem (HA) Ptačí viry jsou nejvariabilnější (rezervoár) Ptačí původ měla většina pandemií Prasata - mohou být napadena lidským i ptačím virem

6.4 Human immunodeficiency virus AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) Objeven 1983 HIV1 (Pan troglodytes troglodytes, Šimpanz čego) HIV2 (Cercocebus atys, Mangabej bělokrký) Napadá buňky IS: CD4 + T lymfocyty (T4), makrofágy (tropismus) - mutace Genom: 2 x [+]RNA, 10 kb, 9 genů Retrovirus (RNA→DNA) Obalený (gp120, gp140) Mutabilita: 3 x Nobelova cena 2008

Replikační cyklus 1) Adsorbce na receptor + koreceptor 2) Fúze obalu s membránou buňky 3) Reverzní transkripce (ssRNA → dsDNA) 4) Transport dsDNA do jádra, integrace 5) Na viru nezávislá aktivace buňky (nutná pro replikaci viru), TF: NF-κB 6) Transkripce, translace a processing proteinů 7) Transkripce genomové RNA 8) Organizace nezralých nukleokapsid (gag, gag-pol, 2x RNA, tRNA) 9) Pučení virionů, maturace (rozstříhání polyproteinu) 10) Lyze buňky (jen T4)

Genom HIV LTR: Regulační sekvence U3,R,U5 Gag: Strukturní p. kapsidy Pol: Replikace Env: Obal Tat: Transkripce Rev: Transport a regulace mRNA Vpr: Transport DNA do jádra Vpu: Pučení virionů, superinfekce Nef: Brání superinfekci Vif (blok deaminace) Ve virionu 2 molekuly RNA (pseudodiploidní, 1 DNA) ve vazbě s tRNA (primer) Běžné retroviry: pouze Gag, Pol, Env

Vstup do buňky Receptor: CD4 Koreceptor: CCR5 u M, CXCR4 u T4 Env: V3 sekvence zodpovědná za tropismus T-tropní viry: fúze nakažené buňky s jinou T4

Replikace genomu Reverzní transkriptáza: RNA dep. DNA pol. DNA dep. DNA pol RNáza H PP: polypurinová sekvence

Integrace Integráza (z polyproteinu Pol) 1.Štěpení 2. Ligace Vznik přímých repetic (okolo místa inzerce) Místně specifická transpoziční rekombinace Náhodné místo v genomu (specificita se vztahuje k cDNA viru) Souvislosti: DNA - Rekombinace

Transkripce LTR U3: Promotor, enhancery, start R: Polyadenylační signál Transkripční interference, pouze levý promotor je funkční RNA pol. II (cap, poly(A)) Jediný transkript

Regulace sestřihu mRNA 1) Vícenásobný sestřih → Rev protein 2) Rev protein stabilizuje ne zcela sestřižené mRNA A) Jednoduše sestřižené mRNA B) Nesestřižené mRNA (genomové)

Genová exprese: triky Frameshift (posun čtecího rámce): Gag nebo Gag-Pol Alternativní sestřih Překrývající se geny Polyproteiny Posttranslační štěpení

Vliv na hostitele Napadá klíčové buňky imunitního systému (T4): problém T4 buňky umírají: A)Následkem replikace viru B)Apoptoticky (programovanou smrtí) C)Vlivem T8 cytotoxických lymfocytů Zdravotní následky: 1)Suprese imunity: oportunistické infekce, nádory 2)Poškození mozku (demence), makrofágy Souvislosti: Buněčný cyklus Souvislosti: Buněčná signalizace

Průběh infekce Rezistence: Mutace v genu pro koreceptor CCR5-Δ32 ( % Evropanů) 1 alela - zpoždění cca o 2 roky, 2 alely silná rezistence, není neg. efekt Akutní fáze (připomíná chřipku): ↑↑HIV, ↓↓T4 Latentní fáze: ↓HIV, ↑T4, ↑ protilátky/T8 - stagnace AIDS: ↑HIV, ↓T4, ↓ protilátky/T8

Léčba Mutabilita → rezistence, proto kombinovaná léčba HAART: highly active antiretroviral therapy A) Inhibitory reverzní transkriptázy B) inhibitory proteázy Inhibitor proteázy: reakce

Shrnutí Vir = nebuněčná částice, reprodukující se v buňce Základní dělení virů: DNA, RNA, retro Existuje mnoho různých virových strategií Modelové viry (patogeny, E. coli) Virus je vázán na omezený okruh hostitelů Využití buněčných procesů/struktur pro svůj prospěch