Stanovení citlivosti mikroorganismů k ATB Mgr. Petra Straková Podzim 2014 Cvičení z obecné mikrobiologie

Antibiotika  Látky používané v klinické praxi k terapii (profylaxi) infekčních onemocnění  Původně: přírodní produkty mikroorganismů (penicilin, streptomycin), dnes: chemicky modifikované látky či připravované uměle  =AML – antimikrobiální látky  Zvlášť: antimykotika, antituberkulotika, antivirotika  Definice: „ Jakákoliv látka přirozeného, semisyntetického nebo syntetického původu, která již ve velmi nízkých koncentracích (µg/ml) může inhibovat nebo usmrtit (citlivé) mikroorganismy (prostřednictvím specifických inhibičních účinků na specifické děje).“

Antibiotika  První ATB z Penicillium notatum, zavedený r do praxe  Další ATB měla společnou strukturu – β- laktamový kruh  léta – éra objevu PNC  léta – éra ATB, průmyslová výroba  léta – éra výzkumu a zavádění syntetických derivátů  80.léta-21.stol. – éra vylepšování vlastností  Nyní – éra vývoje nových ATB proti rezistentním organismům

Antimikrobiální látky  Látky - -STATICKÉ – inhibice růstu - zástava množení - metabolický klid - -CIDNÍ – usmrcení !! Ale nic není 100% !!

Mechanismus účinku  Inhibice syntézy buněčné stěny (BS)  Poškození syntézy a funkce cytoplazmatické membrány (CM)  Inhibice proteosyntézy  Porucha syntézy nukleových kyselin  Antagonismus a kompetitivní inhibice  Primární vs. Sekundární účinek  Primární – baktericidní – rostoucí vs. nerostoucí bakterie  Sekundární – primárně statické, ale např. zvýšením koncentrace změna na cidní

Mechanismus účinku

Rezistence na ATM  „Mikroorganismus je rezistentní, jestliže je schopen růstu ve vyšších koncentracích léčiva v porovnání s fylogeneticky příbuznými kmeny.“  Posuzování: genetické, biochemické, mikrobiologické (in vitro) a klinické (in vivo)  Primární (přirozená) vs. Sekundární (získaná) rezistence  Primární – geneticky podmíněná necitlivost nebo snížená citlivost, bez ohledu na to, jestli došlo k předchozímu kontaktu s ATB či nikoliv  Chybí cílová struktura, nebo je modifikovaná = původní vlastnost MO  Necitlivost může být vůči 1 látce nebo k celé farmakologické skupině  Necitlivost specifická rodově či druhově

Rezistence na ATM  Sekundární – vzniká v průběhu léčby nebo následkem předchozí antibiotické léčby  Během působení ATB se selektují rezistentní bakteriální varianty  Je specifická pro kmeny (populace určitého rodu nebo druhu) (příklad Escherichia coli)  Původu ENDOGENNÍHO – mutace, u bakterií, které nedisponují mechanismy předávání genetického materiálu; skokový nárůst rezistence (1 mutace) či nárůst ve více stupních (více mutací)  Původu EXOGENNÍHO – horizontální přenos cizí genetické informace  -> ALE MOŽNÁ KOMBINACE obou původů

Rezistence na ATM  4 základní mechanismy :  Změna cílové struktury  Impermeabilita  Enzymatická inaktivace ATB  Hyperprodukce cílové struktury

Laboratorní diagnostika  Diluční metody  Difúzní metody  Molekulární metody

1.úkol  Disková difúzní metoda - cílem je prokázat rezistenci (citlivost) k testovaným bakteriálních kmenů k antibakteriálním látkám - kvalitativní metody – C (citlivost) - R (rezistence) - I (intermediární)  Hustý nátěr bakteriální kultury  Přidají se disky napuštěné určitým ATB

1.úkol

2.úkol  Diluční metoda - cílem je prokázat stupeň rezistence (citlivosti) testovaných bakteriálních kmenů k antibakteriálním látkám - kvantitativní stanovení – stanovení hladiny MIC (minimální inhibiční koncentrace)

2.úkol  Rozvařené a vytemperované médium rozpipetujeme do sterilních zkumavek, do nich následně přidáme 0,5 ml inokula S.aureus  Obsah zkumavek vylijeme do sterilních Petriho misek a necháme se ztuhnout  připravíme řadu ředění látek na koncentrace: 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625; 7,81 atd..  Vyhloubíme korkovrtem jamky a do každé jamky nakapeme 0,04 ml dané koncentrace látky  Inkubace 24 hodin 37 °C.

Hodnocení 1. úkol  Měříme zóny – 2 na sebe kolmé přímky 2. Úkol  Měříme zóny – 2 na sebe kolmé přímky, sestavíme kalibrační přímku, z ní se stanoví koncentrace