Genetická informace je zakódována v pořadí mononukleotidů, které tvoří heteropolymerní polynukleotidové řetezce - nukleové kyseliny. Rozdělení nukleových kyselin: -deoxyribonukleová kyselina (DNA) - pentosa deoxyribosa - purinové baze – adenin, guanin - pyrimidinové baze – thymin, cytosin - kyselina trihydrogenfosforečná -ribonukleová kyselina (RNA) - pentosa ribosa - purinové baze – adenin, guanin - pyrimidinové baze – uracil, cytosin - kyselina trihydrogenfosforečná

Struktura DNA Chargaffova pravidla: 1)podíl A = podílu T; podíl C = podílu G 2)množství purinů = množství pyrimidinů Párování bazí: A ↔ T C ↔ G Syntéza nových řetězců ve směru: 5´ → 3´ Sekundární struktura DNA: 1)konformace B - nejčastěji (viz. obr B) - pravotočivá dvoušroubovice - > 40% vody 2) konformace A - < 40% vody 3) konformace Z AB

Struktura RNA - nevyskytuje se nukleotid thymin, je nahrazen uracilem - párování bazí při syntéze RNA: A ↔ U; C ↔ G - základní typy RNA: hnRNA – heterogenní nukleární RNA - vzniká jako primární transkript strukturního genu u eukaryot mRNA – mediátorová RNA - vzniká jako primární transkript strukturního genu u prokaryot nebo posttranskripčními úpravami z hnRNA u eukaryot tRNA – transferová RNA - slouží jako přenašeč aktivovaných aminokyselin při translaci rRNA – ribozomální RNA - stavební složka ribozomu

Enzymy důležité pro nukleové kyseliny 1. Enzymy syntetizující a spojující a) na DNA závislé DNA polymerázy (DNA polymeráza I. - III.) b) na DNA závislé RNA polymerázy (RNA polymeráza I. - III.) c) na RNA závislé DNA polymerázy (revezní transkriptázy) d) DNA a RNA ligázy (polynukleotid syntázy) 2. Enzymy štěpící a) exonukleázy (odštěpují DNA nebo RNA od volných konců) b) endonukleázy (enzymy štěpící DNA nebo RNA uvnitř řetězce, viz. následující obrázek) 3. Ostatní enzymy a) enzymy s kombinující aktivitou (syntetická a štěpící aktivita dohromady) b) modifikující enzymy I. polynukleotidkináza (přenos koncového fosfátu z ATP na 5´konec DNA/RNA) II. alkalická fosfatáza (odštěpuje 5´koncové fosfáty při uchování fosfodiesterové vazby) III. nukleotid metyláza (napojování metylových skupin na baze)

Štěpení restrikčními endonukleázami a) lomivé štěpení s kohezními konci enzym Eco RI 5´G A A T T C3´ 3´C T T A A G 5´ b) zarovnané štěpení s tupými konci enzym Hpa I 5´G A A T T C3´ 3´C T T A A G 5´

Genom Genom je soubor veškerého genetické materiálu podbuněčných forem, buňky, jedince nebo druhu. Genom je tvořen následujícími sekvencemi: a) strukturní geny – kódují proteiny b) geny řídící syntézu ribozomální RNA (rRNA) a tranferové RNA (tRNA) c) regulační sekvence – rozpoznávány specifickými faktory pro regulaci procesů replikace, transkripce nebo translace d) pseudogeny – mají podobnou strukturu jako strukturní geny, jsou však nefunkční e) repetitivní sekvence – tvoří převážnou část eukaryotního genomu, jedná se o opakující se motivy určitých sledů bazí

Genom rostlin a živočichů zdroj obrázků: cs.wikipedia.org Genom rostlin: - jaderný genom (lineární) - mitochondriální genom (mtDNA) (kruhový) - chloroplastový genom (ctDNA) (kruhový) Genom živočichů: - jaderný genom (lineární) - mitochondriální genom (mtDNA) (kruhový)

Srovnání velikosti genomu OrganizmusVelikost genomu (bp)Poznámka VIRYBacteriophage MS osekvenovaný RNA genom SV Phage Φ-Χ osekvenovaný DNA genom Phage λ5 x 10 4 BAKTERIECarsonella rudi1,6 x 10 5 nejmenší nevirový genom Buchneria aphidicola6 x 10 5 Escherichia coli4 x 10 6 PRVOCIMěňavka (Amoeba dubia)6,7 x největší známý genom (2005) ROSTLINYHuseníček (Arabidopsis thaliana)1,57 x 10 8 Masožravka (Genlisea margaretae)6,34 x 10 7 nejmenší popsaný rostlinný genom Řebčík (Fritillaria assyrica)1,3 x Topol (Populus trichocarpa)4,8 x osekvenovaný genom stromu (2006) KVASINKYSaccharomyces cerevisiae2 x 10 7 HOUBYAspergillus nidulans3 x 10 7 ČERVYCaenorhabditis elegans9,8 x osekvenovaný mnohobuněčný genom (1998) HMYZOctomilka (Drosophila melanogaster)1,3 x 10 8 Bourec (Bombyx mori)5,3 x 10 8 Včela (Apis mellifera)1,77 x 10 9 RYBY Čtverzubec (Tetraodon nigroviridis ) 3,85 x 10 8 nejmenší známý genom obratlovce Bahník (Protopterus aethiopicus)1,3 x největší známý genom obratlovce SAVCIČlověk (Homo sapines)3 x 10 9

Dogma molekulární biologie a funkční vztahy nukleových kyselin s proteiny

Replikace DNA Schéma replikační vidlice Základní charakteristika: 1)semikonzervativní každý z řetězců původní dvoušroubovice je předlohou pro syntézu nového 2) semidiskontinuální rozdílná rychlost syntézy nových řetězců (tzv. Okazakiho fragmenty na opožďujícím se řetězci Rozdělení replikace do čtyř částí: 1)Iniciace replikace 2)Elongace (prodlužování) řetězce 3)Terminace 4)Reparace (oprava) replikačních chyb Replikace je syntéza DNA podle předlohy DNA nebo RNA podle předlohy RNA.

1) Iniciace replikace - vazba proteinů na místo ori (ori = origine – začátek replikace) - helikáza rozvírá dvojspirálu DNA - SSB (single strand biinding) proteiny zabraňují znovu spojení řetězců - DNA primáza napojí krátké RNA primery (do 10 nukleotidů) 2) Elongace (prodlužování) řetězce - DNA polymeráza za přítomnosti volných dNTP syntetizuje komplementární dceřinné řetězce 3) Terminace - ukončení syntézy komplementárních dceřinných řetězců - popsány specifické sekvence – terminátory replikace (ter) 4) Reparace (oprava) replikačních chyb - chyba 1 : řada polymeráz provádí zpětnou kontrolu

Animace replikace

Transkripce Transkripce je syntéza RNA podle předlohy DNA Rozdělena do čtyř fází: 1)Iniciace Vazba RNA polymerázy na specifické sekvence tzv. promotory (př. TATA box, CAT box) 2) Prodlužování (elongace) transkripce Syntéza RNA na základě komplementarity s negativním DNA řetězcem pomocí RNA polymerázy 3) Ukončení (terminace) transkripce RNA postupuje do místa zvaného terminátor, kde dochází k ukončení transkripce

- připojení čepičky – chrání 5´konec - sestřih hnRNA - vyštěpení nekódujících sekvenci (intronů) a zůstávají jen exony → vzniká „zralá“ mRNA - polyadenylace – napojení cca 250 A na 3´konec - vnitřní metylace 4) Posttranskripční úpravy (př. hnRNA)

Animace transkripce sntU&feature=related

Translace I. Translace je překlad sekvence nukleotidů do pořadí aminokyselin v proteinu terciární struktura „L“ akceptorové rameno A rameno antikodon D rameno T rameno variabilní smyčka tRNA (transferová RNA) α - antikodonovém rameno s antikodonem β - akceptorové rameno γ - variabilní smyčka δ – dihydrouridinové rameno s DHU-smyčkou τ - pseudouridinové rameno s Tψ C-smyčkou primární struktura „jetelový list“ zdroj obrázků: en.wikipedia.org

Translace II. Iniciace (I.) a elongace (II.) translace Skládá se ze čtyř fází: 1)Aktivace aminokyselin - navázaní příslušné aminokyseliny na 3´konec tRNA 2) Iniciace translace - syntéza probíhá na buněčných organelách – ribozomech a začíná tvorbou iniciačního komplexu - iniciační kodom AUG (metionin) 3) Elongace translace -na základě komplementarity kodonu (mRNA) a antikodonu (tRNA) jsou začleňovány další aminokyseliny a tvoří za tvorby peptidové vazby 4) Ukončení translace - po dosažení terminačního kodonu (UAA, UAG a UGA) dochází k zastavení translace

Genetický kód Soubor pravidel, podle nichž je informace uložená v pořadí nukleotidů v mRNA přeložena do primární struktury proteinu (pořadí aminokyselin). Vlastnosti genetického kódu: 1)Tripletový - základní jednotkou trojice nukleotidů (kodon) 2)Nepřekrývající se – záleží na začátku čtení (nedochází k posunu čtecího rámce); kodon komplementární s tripletem na tRNA (tzv. antikodonem) 3)Univerzální – smysl platí pro veškerý život (výjimka mitochondrie) 4)Degenerovaný – jedna aminokyselina kódována více triplety AUG → iniciační/metionin UAA → terminační kodon (ochre) UAG → terminační kodon (opal) UGA → terminační kodon (amber)/selenocystein

Animace translace EAo&feature=related

Proteosyntéza v umění lidský ThyA protein (thymidylát syntása A) a) (Trp-C, Met-D, Pro-E, His-F, Tyr-G, Phe-A, Leu-B, Ile-C, Val-D, Ala-E, Cys-F, Gly-G, Thr-A, Ser-B, Gln-C, Asn-D, Glu-E, Asp-F, Arg-G, Lys-A) b) Trp-C, Met-D, Pro-E, His-F, {Tyr-G (RP), Phe-G (FI)}, {Leu-A (RP), Ile- A (FI)}, {Val-B (RP), Ala-B (FI)}, Cys-C, Gly-D, {Thr-E (RP), Ser-E (FI)}, {Gln-F (RP), Asn-F (FI)}, {Glu-G (RP), Asp-G (FI)}, {Arg-A (RP), Lys-A (FI)} Conversion of amino-acid sequence in proteins to classical music: search for auditory patterns Rie Takahashi and Jeffrey H Miller Genome Biology 2007, 8:405

Regulace genové činnosti Nezbytným předpokladem je zapojení nebo vypnutí žádoucích genů ve správném čase, na správném místě a ve správné míře. Syntéza nukleových kyselin je tedy regulována na všech stupních transkripce, posttranskripčních úprav, translace a posttranslačních úprav. a)na úrovni transkripce modely prokaryot (s určitými odchylkami platí i u eukaryot) negativní regulacepozitivní regulace represor promotor operátor strukturní gen regulační gen promotor operátor strukturní gen stop

Omezení operonového modelu pro eukaryonty: 1)u eukaryot jednogenová mRNA 2)geny přerušovány introny 3)specifičtější regulace genů 4)transkripce pletivově a orgánově specifická 5)specifické regulační oblasti (např. zesilovače – viz. dále) 6)u rostlin je transkripce ovlivňována fytohormony 7)specifická konformace bílkovin usnadňující vazbu aktivačních a regulačních bílkovin

zesilovač promotor strukturní gen zesilovače transkripce K zesílení účinnosti promotoru může vést vazba většího počtu specifických transkripčních faktorů na specifickou sekvenci tzv. zesilovač.

b) Regulace při posttranskripčních úpravách alternativní způsoby úpravy hnRNA -různé sestřihy stejné hnRNA -posttranskripční úpravy i dalších RNA (tRNA a rRNA) – sestřih, štěpení a chemické modifikace c) Regulace během translace bakterie – proteiny z některých operonů mají regulační funkce eukaryoti – velmi různorodé - ne syntéza specifického proteinu, ale regulace množství d) Regulace po translaci modifikace proteinu: -Kovalentní modifikace – vazby dalších chemických struktur, např. fosforylace, acetylace atd. -Štěpení – teprve po štěpení se protein stává funkční -Vznik kvarterních struktur – spojování proteinových řetězců do vyšších konformací

Genové mutace Představují změnu v jednom genu. Může postihnout jeden nebo několik nukleotidů určitého genu, přičemž nedochází ke změně pořadí a polohy genů. Rozdělení: a) Nukleotidové substituce Jedná se o výměnu nukleotidů (RNA) nebo nukleotidových párů (DNA) v nukleových kyselinách. b) Posunové mutace Mutace mající za následek posun čtecího rámce při proteosyntéze.

a) Nukleotidové substituce Tranzice – představuje výměnu purinového nukleotidu za purinový a pyrimidinového za pyrimidinový, tzn. A↔G nebo C↔T. Transverze – je výměna purinového nukleotidu za pyrimidinový a naopak, tzn. A, G↔C, T. Molekulární podstata substitučních mutací: Tautomerie purinových a pyrimidinových bazí Kolísavost v párování bazí Depurinace a depyrimidinace Inkorporace uracilu do DNA během semikonzervativní replikace Oxidativní poškození DNA

Tautomerie purinových a pyrimidinových bazí standardní párování bazí zdroj obrázků: Rosypal (2000)

Kolísavost v párování bazí vzniká deaminací adeninu zdroj obrázků: Rosypal (2000)

Depurinace a depyrimidinace hypoxantin se může párovat s A, C a U xantin se nemůže párovat s C a T - zastavení syntézy polynukleotidového řetězce na matricovém řetězci zdroj obrázku: Rosypal (2000)

Inkorporace uracilu do DNA během semikonzervativní replikace -inkorporace dUTP za dTTP -během replikace účinně odstraňován enzymem uracil-DNA-glykosylasa Oxidativní poškození DNA Způsobuje hydroxylový radikál.OH, který vzniká: 1.H 2 O 2 (vedlejší produkt metabolizmu) 2.radiolýzou H 2 O vlivem ionizujícího záření V rostlinných a živočišných buňkách se 8-oxoG tvoří spontánně bez ionizujícího záření a příčinou spontánního poškození DNA.

Fenotypový projev substitučních mutací a) tiché mutace (neutrální mutace) Dochází ke změně kodonu, ale v důsledku degenerovanosti genetického kódu nedochází ke změně AK nebo dojde ke změně AK, ale změna se neprojeví ve funkci polypeptidového řetězce. Synonymní substituceNeutrální substituce -DNA (původní)3´ ACG GGC AAT ACG GGC AAT 5´ mRNA5´ UGC CCG UUA UGC CCG UUA 3´ protein Cys Pro Leu Cys Pro Leu -DNA (zmutovaná)3´ ACG GGT AAT ACG AGC AAT 5´ mRNA5´ UGC CCA UUA UGC UCG UUA 3´ protein Cys Pro Leu Cys Ser Leu b) mutace měnící smysl kodonu Změna kodonu a i změna funkce proteinu. S pozměněným smyslemMutace nesmyslná (beze smyslu) -DNA (původní)3´ ACG GGC AAT ACG GGC AAT 5´ mRNA5´ UGC CCG UUA UGC CCG UUA 3´ protein Cys Pro Leu Cys Pro Leu -DNA (zmutovaná)3´ ACG TGC AAT ACT GGC AAT 5´ mRNA5´ UGC ACG UUA UGA CCG UUA 3´ protein Cys Thr Leu amber – stop syntézy proteinu

b) Posunové mutace Delece – ztráta jednoho nebo více nukleotidů. původní -DNA3´TAT ACG TGC AAT CGA5´ mRNA5´AUA UGC ACG UUA GCU3´ protein Ile - Cys – Thr – Leu - Ala zmutovaná -DNA3´TAT ACG GCA ATC GA5´ mRNA5´AUA UGC CGU UAG CU3´ protein Ile – Cys – Arg – opal (ukončení syntézy proteinu) Posun čtecího rámce doleva. Inzerce (adice) – vložení jednoho nebo více nukleotidů. původní -DNA3´TAT ACG TGC ↓AAT CGA5´ mRNA5´AUA UGC ACG UUA GCU3´ proteinIle - Cys – Thr – Leu - Ala zmutovaná -DNA3´TAT ACG TGC AAA TCG A5´ mRNA5´AUA UGC ACG UUU AGC U3´ proteinIle – Cys – Thr – Phe - Ser Posun čtecího rámce doprava. Inzerce nebo delece, které jsou násobkem tří nukleotidů, čtecí rámec obnovují.

Reverze – úplná nebo částečná změna mutantního fenotypu ve standardní pomocí zpětné nebo supresorové mutace (v jiném místě něž původní mutace) pravá – druhou mutací, ve stejném místě jako původní, dojde ke změně tripletu na shodný s původním před první mutací. -DNA AGG (Arg) → zmutovaná -DNA TGC (Trp) → pravá reverze -DNA AGG (Arg) operační - druhou mutací, ve stejném místě jako původní, dojde ke změně tripletu na triplet kódující stejnou aminokyselinu jako původní před první mutací. -DNA AGG (Arg) → zmutovaná -DNA TGC (Trp) → operační reverze -DNA CGG (Arg) Reparace poškozené molekuly DNA – enzymaticky řízené procesy, kterými se do jisté míry poškození a chyby v genomové DNA odhalují, opravují a odstraňují. Mnohočetný alelismus – gen zmutovaný do několika stavů (několika alel), např. A 1, A 2, A 3, A 4 atd.

Příklady genový mutací - typ substituce PSE (pale, sof, exudative = světlé, měkké, vodnaté) maso prasat abnormálně rychlé glykogenolýza a hromadění kyseliny mléčné pokles pH pod 5,8 a zvýšení teploty nad 42 o C denaturace bílkovin, porušení struktury vláken,uvolnění mastné šťávy, změna barvy a konzistence svaloviny gen ryanodinového receptoru RYR1 (NN; Nn; nn – náchylní jedinci) substituce C za T (pozice 1843) = recesivní alela n zdroj: labs.ansci.uiuc.edu NNnnNn

Příklady genový mutací - typ delece CYSTICKÁ FIBRÓZA transport chloridových iontů vlivem mutace se v plicích postižených tvoří hustý viskózní hlen - obtížné dýchání, záněty a následně těžké poškození plic dnes známo přes 800 mutací CFTR genu, v české populaci 70% představuje mutace deltaF508, druhá nejčastější CFTRdele2,3 mimo plic ucpává hlen i jiné orgány (způsobuje např. neplodnost) prognóza: léčbou lze docílit věku cca 30 let Obrázky A a B poskytnuty: Ing. Ježíškovou z Laboratoře DNA diagnostiky, Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice Ostrava A B

Replikace in vitro (PCR – polymerázová řetězová reakce) - základní nástroj v molekulární biologii denaturace anneling (nasedání primerů) elongace (prodlužování) denaturace elongace annealing cyklus 1 cyklus 2 Základná složky reakce: templatová DNA pufr MgCl 2 dNTP primery DNA polymeráza (Taq polymeráza) Základní kroky: Denaturace vytvoření dvou jednovláknových DNA (ssDNA) jako matric pro syntézu (95-97 o C) Annealing (nasedání primerů) připojení oligonukleotidových řetezců o nichž začíná syntéza nových řetězců (30-65 o C) (teplota odvislá od metody) Prodlužování řetězce syntéza nového řetězce na základě komplementarity s matricí (72 o C) Počet cyklů x 2 28 = fragmentů DNA zdroj: members.aol.com (upraveno)

Co se detekuje v molekulární biologii: a)bodový polymorfismus – změna v sekvenci bazí b)variabilita repetitivních (opakujících) sekvencí – jejich velikost a poloha Charakteristika DNA markerů: -aplikovatelné u organismů, kde je zvládnuta izolace DNA, -nejsou závislé na podmínkách prostředí, -téměř neomezeny počet, -aplikace i při minimálním množství biologického materiálu i v raných stádiích vývoje -jsou nedestruktivní Rozdělení DNA markerů: a)založené na hybridizaci DNA se značenou DNA sondou známého původu a sekvence b)založené na PCR (amplifikaci in vitro)

Existuje velké množství metod a jejich modifikací, které jsou náplní specializovaných předmětů. Pro přehled uvádím, alespoň základní metody molekulární biologie. RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) – délkový polymorfizmus restrikčních fragmentů – založeno na vyhledávání změn v sekvencích DNA, které jsou místem pro štěpení restrikčními enzymy SPLAT (Specific Polymorphic Locus Amplification Test; syn. STS – Single Tagged Site) – amplifikace specifických lokusů – pomocí dvojice specifických primerů je amplifikován specifický fragment (lokus). -produkt (fragment DNA) vzniká při přítomnosti specifického lokusu ve vzorku DNA -absence produktu = absence specifické varianty genetické informace CAT GTA GGCCAT GTG GGC restrikční enzym neštěpí (DNA zůstává celistvá) restrikční enzym štěpí (DNA = 2 různě velké fragmenty) AA Aa aa umožňuje rozlišit heterozygoty

RAPD (Randomly Amplified Polymorhic DNA) – náhodná amplifikace polymorfní DNA – amplifikace fragmentů DNA za použití jednoho krátkého náhodného primeru. SSR (Simple Sequence Repeats) – variabilita mikrosatelitů DNA – pomocí dvojice specifických primerů detekujeme variabilitu v délce mikrosatelitů, tj. krátkých tandemových repetic 1-5 nukleotidů; př. (A) n, (AC) n, (CGG) n atd. -organismy se liší počtem opakování, tzv. velikostí výsledného produktu -umožňuje rozlišit heterozygotní konstituci templátová DNA primer vzorek A vzorek B srovnáváme počet a velikost náhodných fragmentů AA Aa aa

AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) – délkový polymorfizmus amplifikovaných fragmentů – založeno na selekci restrikčních fragment genomové DNA pomocí PCR amplifikace. Real Time - PCR (PCR v reálném čase) – amplifikace probíhá jako standardní PCR s přídavkem specifické vnitřní sondy (TaqMan sonda). Fluorescenční signál je vydáván jen v průběhu amplifikace, jinak je energie z tzv. reportérem (5´konec) pohlcována tzv. zhášečem (3´konec). - kvantitativní PCR – sloužící např. ke kvantifikaci transgenu v biologickém materiálu Metoda poskytuje velké množství polymorfních fragmentů

Aplikace technik molekulární biologie (modelový příklad – identifikace pachatele) izolace DNA oděv oběti aplikace DNA metod pro zjištění polymorfizmu (variability) srovnání s DNA oběti srovnání DNA s možnými pachateli nebo databází vzorek se neshoduje s DNA oběti hledaní nových stop s DNA (krev, kůže apod.) vzorek se shoduje s DNA oběti v USA databáze CODIS pachatel