 nativní – pozorování skute č ného tvaru, pohybu  fixovaný barvený - barvení bun ěč né st ě ny nebo struktur, bu ň ky jsou usmrcené fixací nad plamenem nebo chemicky (etanolem nebo acetonem), usmrcené bu ň ky lépe p ř ijímají barvivo a lépe p ř ilnou k podlo ž nímu sklí č ku Zdroje: Mikrofoto preparát ů p ř edm ě tu Bi7340 (rok 2007) !!Atlas mikroorganism ů :

Morfologie Bu ň ky Charakteristických shluk ů bun ě k Extracelulárních útvar ů (spory, konidie, sporangia, pouzdra..) Bakteriální kolonie V ě tšinou druhov ě charakteristické = identifika č ní znak Pozor na: fázi r ů stového cyklu! endospory vyklenující bu ň ku stá ř í kultury pleomorfní bu ň ky Clostridium botulinum endospora bu ň ka char.shluk koloniesporangium spory

Pleomorfní bu ň ky rodu Corynebacterium Mycobacterium avium-intracellulare Acidorezistentní barvení bun ě k histologického ř ezu lymfatické uzliny Pleomorfní bu ň ky M. tuberculosis Morfologie pleomorfních bun ě k. Další potí ž : Jsou barvitelné Gramem? Haemophilus – ano Mykobakteria, mykoplazmata - nikoli Acidorezistentní bu ň ky: Odmítají Gramovo barvení Odmítají se po nabarvení odbarvit ethanolem i kyselinou. P ř : Corynebacterium, Nocardia… Bez b.s. Mykolové kys

Mycobacterium tuberculosis Zeihl-Neelsonovo barvení ( č erven ě ) Je neznámý vzorek v ů bec barvitelný Gramem? Není gramlabilní? S barevným filtrem Cíl mikroskopie? Typ preparátu Typ mikroskopie (typ b. st ě ny, pr ů kaz struktur, r ů stového cyklu) Ž ivý (nativní) preparát bez fixace– vidíme nedeformovaný tvar bu ň ky, spory, morfologii seskupení bun ě k, pohyb bun ě k Ž ivé a mrtvé b., pohyb Fixov. prep. – tvar a typ b. Fixov. prep. nebarvitelný Gramem

Morfologie bu ň ky PREPARÁT - co chceme vid ě t? – podle toho preparát a typ mikroskopie tvar bu ň ky – fázový kontrast, barvený fixovaný prep. pohyb bu ň ky – fázový kontrast, fluorescence barvené struktury – pomáhají identifikaci (PHB, síra) typ bun ěč né st ě ny – Gramovo a acidorezistentní b. rychlá p ř íprava nativního preparátu barvení bun ě k a spor za horka a struktur Gramovo barvení sv ě telná mikro- skopie Sv ě telná Fázový kontrast Fluorescen č ní Elektronová…

U jednoho bakteriálního rodu r ů zný vzhled char. tvaru bu ň ky! P ř : ty č ky bacil ů Haemophilus Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus subtilis 10 μm H. influenzae H. ducrei Pseudomonas P. aeruginosa P. fluorescens

Posuzujeme-li vzhled bu ň ky ur č itého bakteriálního druhu, je t ř eba si uv ě domit: 1) Prochází tento druh r ů stovými cykly? - v ka ž dém z nich má pak bu ň ka jinou morfologii! P ř : Chlamydia Bdellovibrio, Streptomyces, Caulobacter, myxobakterie…. M ě ní se nejen vzhled bu ň ky, ale bu ň ka v cyklech prochází typickou zm ě nou vnit ř ních struktur. Bun ěč ný cyklus Caulobacter crescentus

Bacillus Bdellovibrio Myxobakterie

Morfologie bu ň ky vprost ř ed bun ěč ného cyklu Ž ivotní cyklus rodu Bacillus - u n ě kterých jeho druh ů i u jiných rod ů navíc r ů zná barvitelnost Gramem p ř i r ů zném stá ř í bun ě k – a ž gramlabilní p ř i popisu preparátu nutno uva ž ovat stá ř í bun ě k!

2) Vytvá ř í posuzovaný druh endospory? - v preparátu pak mohou m ě nit tvar bun ě k! „Voják umírající na tetanus“ Sir Charles Bell lukovité prohnutí zad (opistotonus) k ř e č ovitý výraz Originál je k vid ě ní: Royal College of Surgeons of Edinburgh, Scotland. Clostridium difficile Clostridium tetani Bacillus anthracis

3) Stárnutím m ě ní bu ň ky tvar 4) Závislost tvaru bu ň ky na vn ě jším prost ř edí - ž iviny, tlak, osmolarita… 5) pleomorfní bu ň ky – p ř. rody Mycobacterium, Corynebacterium, Haemophillus, Mycoplasma Corynebacterium Pleomorfní mykoplazmata: nejmenší bakteriální bu ň ky (0,2 – 0,3 μm); bez buněčné stěny! Poté: Nepůsobí betalaktamy Osmoticky stabilní v host.b. 1 μ m velké bu ň ky se v cyklu st ř ídají s elementár.t ě lísky výb ěž ky

Morfologie bakt. kolonií pot ř eba zvá ž it typ media, ne kterém kolonie hodnotíme! kultivace - zda v ů bec kultivovatelné?? - sledování typu kolonií P ř : sledování morfologie kolonií – univerzální media, jiný vhled na selektivním – zda v ů bec r ů st č i ne? barevná reakce?) S-, R- a M-formy sledování pohybu terasovité kolonie (P ř : Proteus) Proteus

Proteus – pohyb bun ě k Bacillus mycoides Serratia marcescens Streptomyces Morfologie bakteriálních kolonií I. na základních p ů dách Nocardia

E.coli na krevním agaru E.coli na MacConkey agaru Lac+ E.coli na agaru EMB (Eosin Methylene Blue Agar) Bakteriální kolonie na II. diagnost. p ů dách Jeden druh bakterie r ů zná media E.coli na C.L.E.D. mediu Cysteine Lactose Electrolyte Deficient Agar

Mycobacterium tuberculosis obohacená a selektivní Löwenstein-Jensenova medium selektivní a ž na kmen! Detekce kmene E. coli O157:H7 proti jiným kmen ů m E. coli Bakteriální kolonie na III. selektivních p ů dách

Kontaminace na misce!

Morfologie charakteristických shluk ů bun ě k typické shluky napomáhají identifikaci ř etízky kok ů : Streptococcus ř etízky bacil ů : Bacillus palisády: Corynebacterium tetrády kok ů : Micrococcus balí č ky = sarciny Sarcina hrozní č ky: Staphylococcus Streptococcus Micrococcus Staphylococcus Bacillus

Imerzní objektiv: Paprsek přecházející ze skla do imerzního prostředí svůj směr nemění a může se podílet na tvorbě obrazu. Imerzní prostředí - kapalina o stejném n jako krycí sklíčko. Často cedrový olej (n = 1,52). Imerze umožňuje korigovat některé opt. vady mikroskopu. větší index lomu vyšší úhel α vyšší numerická apertura nižší rozlišovací mez NA = 1,2 – 1,4 Pro žlutozelené světlo: Rozlišovací mez 0,4 μ m Suchý objektiv: Paprsek vystupující z preparátu pod úhlem α se na rozhraní mezi krycím sklíčkem a vzduchem láme od kolmice a nemůže se již podílet na tvorbě obrazu. menší index lomu menší numerická apertura vyšší rozlišovací mez n= 1 NA = max 1 Pro žlutozelené světlo: λ = 550 nm NA = 0,95 Rozlišovací mez = 0,6 μ m Rozlišovací mez δ = λ / n. sin α R. Hook - po 1.olejová lampa Kapalina zvyšuje účinek světla

- pozorování sv ě telným mikroskopem - max zv ě tšení 1500krát, max rozlišení 200 η m -pozorování pod imerzí – mokré pracovní prost ř edí umo žň uje v ě tší zv ě tšení, zvyšuje numerickou aparaturu, soust ř e ď uje sv ě telné paprsky

Gramovo barvení Slou ž í pro rozlišení G+, G- a pro ur č ení tvaru bun ě k samotných (koky, kokoty č ky, ty č ky, spirily, pleomorfní bu ň ky, vlákna) a také jejich uspo ř ádání do charakteristických útvar ů (balí č ky, ř etízky bacil ů i kok ů, tetrády, sarciny) Grampozitivní – tmav ě fialové a ž modro č erné zbarvení - komplex barviva a jódu není vyplaven Gramnegativní – č ervené nebo r ůž ové zbarvení – komplex barviva a jódu je odbarven etanolem nebo acetonem a bu ň ky jsou dobarveny safraninem

Micrococcus luteus CCM 169 -Grampozitivní kok zv. 1000× Preparát: DVOJICE ČTVEŘICE SHLUKY

Jaké bakteriální rody Gramovým barvením neobarvíme? Jedná se o rody bez buněčné stěny (mykoplazmata), spirálovité bakterie, dále o silně acidorezistentní rody (např. mykobakteria): Borrelia burgdorferi (fig 1, 2)12 Borrelia recurrentis (fig 1)1 Bartonella henselae (fig 1, 2)12 Chlamydia trachomatis (fig 1, images of elementary bodies, images of reticulate bodies)1images of elementary bodiesimages of reticulate bodies Chlamydophila pneumoniae (images of elementary bodies, images of reticulate bodies)images of elementary bodiesimages of reticulate bodies Chlamydophila psittaci (images of elementary bodies, images of reticulate bodies)images of elementary bodiesimages of reticulate bodies Coxiella burnetii (fig 1, 2)12 Ehrlichia chaffeensis (fig 1, 2)12 Anaplasma phagocytophilum (formerly; Ehrlichia phagocytophilum or E. equi; Fig. 1) Legionella sp. (fig 2)2 Leptospira sp.(fig 1, 2)12 Mycobacterium bovis (fig 1)1 Mycobacterium tuberculosis (fig 1, 2 thanks to Anders Olav Lande, 3)123 Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare (fig 1 thanks to Anders Olav Lande)1 Mycobacterium kansasii (fig 1)1 Mycobacterium leprae (fig 1, for a close up thanks to Anders Olav Lande)1for a close up Mycobacterium marinum (fig 1)1 Rickettsia rickettsii (Fig. 1,: scroll down to bottom of the page. 2)1,2 Orientia tsutsugamushi (formerly; Rickettsia tsutsugamushi; Fig. 1)1 Treponema pallidum(fig 1, 2, 3)123

Micrococcus luteus CCM 169

Dvojice, čtveřice, ale narozdíl od mikrokoka mají kolonie růžový pigment Kocuria rosea

Staphylococcus Zdroj: Jednotlivé buňky Dvojice Hrozníčky

Bacillus cereus CCM Grampozitivní ty č ka zv. 1000× Preparát: DVOJICE JEDNOTLIVÉ BuŇKY ŘETÍZKY

Bacillus cereus CCM 2010

Saccharomyces cerevisiae - eukaryotický typ b., barví se grampozitivn ě !!

– Escherichia coli ( G- krátké tyčky) 2-3 x 0,4-0,6 um Bacillus cereus CCM 2010 ( G+ tyčky)

Serratia marcescens CCM 303 -Gramnegativní ty č ka zv. 1000× Preparát: Jednotlivé drobné tyčinky

Serratia marcescens CCM 303 Gramnegativní ty č ka zv. 1000× Preparát: Jednotlivé drobné ty č inky

Serratia marcescens CCM 303 G- ty č ka zv. 1000×

Pseudomonas fluorescens CCM 2115 G- tyčky