Stáhnout prezentaci
Prezentace se nahrává, počkejte prosím
1
Luminiscenční spektroskopie
hn k k k k k3 A ® A* ® A* ® A+ ® A+ ® A k k3 k4 A hn hn
2
Luminiscenční spektroskopie
3
Luminiscenční spektroskopie
Fluorescenční spektroskopie Fosforescenční spektroskopie Chemiluminiscenční spektroskopie
4
Základní pojmy Excitace a emise Interakce s rozpouštědlem
Singletový excitovaný stav Singletový základní stav
5
Základní pojmy Stockesův posun – ztráty energie po dobu excitovaného stavu Dl F Absorpce Emise nm
6
Základní pojmy l3 l2 l1
7
Základní pojmy Excitovaný stav – střední doba života 10-7 – 10-9 s. O
8
Základní pojmy Kvantový výtěžek fluorescence
= počet kvant emitovaných/počet kvant absorbovaných = ke/(ke + S kk) ke = rychlost emise kk = rychlost konverzních procesů Intenzita fluorescence látky = f (e, F, N)
9
Základní pojmy Doba života excitovaného stavu
Doba potřebná k poklesu fluorescence na hodnotu 1/e Io Střední doba života t = 1/ kf If = I0 e – t/ t n- refrakční index rozpouštědla e – molární abs. Koeficient n – vlnočet abs. maxima Přirozená doba života to Definovaná pro F = 1 ∞ t0 = 2, n2.nA2 . ∫ e(n)dn A n
10
Základní pojmy F = t/t0 Střední doba života fluorescence
Fluorescein 4,6 ns Chininsulfát 15 – 40 ns NADH 0,5 ns
11
Biochemicky významné fluorofory
12
Instrumentace
13
Instrumentace Zdroj: Xenonová lampa Rtuťová výbojka Laser
Světelné diody - LED (430, 450, 505, 592, 612 and 637 nm)
14
Instrumentace Monochromátor mřížka filtry
15
Instrumentace
16
Instrumentace RF-5301PC – spektrofluorimetr Shimadzu
17
Instrumentace Měření střední doby života fluorescence
18
Podmínky fluorescence
Pokles polarity 6 – 1. Závislost na polaritě a viskozitě Nitrobenzoxadiazol
19
Podmínky fluorescence
Závislost fluorescence na teplotě F 80 40 °C
20
Podmínky fluorescence
Stabilita fluorescenčního signálu chininsulfátu F 80 40 min
21
Podmínky fluorescence
450 nm 1 Rayleighův rozptyl (Tyndalův rozptyl) 2 Fluorescenční emise 3 Ramanův rozptyl Excitace 450 nm 600 nm 1 3 2 3 Emisní spektrum
22
Kvantitativní fluorimetrie
Závislost intenzity fluorescence na koncentraci látky F = f (I, e, c, F) F = Io F [1 – 10-ecd] jestliže c ® 0 F = Io F.2,3.ed.c F c
23
Kvantitativní fluorimetrie
Stanovení koncentrace aminokyselin 390/464 nm 340/455 nm 450/550 nm
24
Kvantitativní fluorimetrie
Stanovení bílkovin CBCQA
25
Kvantitativní fluorimetrie
Detekce bílkovin v gelu (barevně: Coomasie blue, stříbrné barvení) Fluorimetricky: SYPRO Orange (Molecular probes) – citlivost 1 – 2 ng
26
Kvantitativní fluorimetrie
Detekce nukleových kyselin Ethidium bromid rRNA 16 a 23s barvená SYBR Green II Molecular Probes
27
Fluorogenní substráty
Galaktosidasy 4-methylumbelliferyl-a-galaktosid Fluorescein-digalaktosid
28
Fluorogenní substráty
Peroxidasy – amplex red, vznik resorufinu
29
Fluorogenní substráty
Proteinasy, peptidasy Fluorescenční konjugáty proteinů a peptidů
30
Fluorogenní substráty
Fosfolipasa A
31
Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Přirozené fluorofory (Tyr, Try) – fluorescence závislá na polaritě prostředí obklopující fluorofor F H2O H2O Emisní spektrum nm
32
Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
substrát F310 t (min)
33
Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Fluorescenční konjugáty OG Karboxyfluorescein – (494/520 nm) CF Absorpce/emise fluoresceinu při pH 9 CF-karboxyfluorescein OG oregon green Oregon Green - (496/524 nm)
34
Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Fluorescenční konjugáty Teramethylrhodamin – 545/580 nm) Kumariny – 350/450 nm)
35
Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Fluorescenční konjugáty Dansyl Benzoxadiazol –N-sukcinimid
36
Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Fluorescenční konjugáty
37
Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
L + M LM Kd = Lf.Mf/LM Interakce makromolekul s ligandy F Ligand vázaný Ligand volný koncentrace makromolekuly
38
Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Ff, Fb – fluorescence volné, vázané frakce Fb, Ff –kvant. Výtěžek fluorescence vázaného, volného ligandu Cb,Cf – koncentrace vázaného, volného Ligandu C – celková koncentrace ligandu F – celková fluorescence F = Ff + Fb F = Cf .Ff + Cb. Fb F = (C-Cb) Ff + Cb. Fb F = CFf – CbFf + Cb. Fb F = Fo + Cb (Fb – Ff) Cb = (F – Fo)/ (Fb – Ff)
39
Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Interakce makromolekul s ligandy Použití fluorescenčních analogů Kys. cis-parinarová Fluorescein-PE Anthroyloxypalmitát
40
Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Použití značené makromolekuly Fluorescence značené bílkoviny F Koncentrace ligandu
41
Fluorescenční rezonanční transfer energie (Försterův přenos)
Nezářivý přenos energie z donoru na akceptor (1 – 10 nm)
42
Fluorescenční rezonanční transfer energie
DONOR F A F nm
43
Fluorescenční rezonanční transfer energie
DONOR AKCEPTOR F A F nm
44
Fluorescenční rezonanční transfer energie
DONOR AKCEPTOR F A F nm
45
Fluorescenční rezonanční transfer energie
Donor Fo F h = 1 – F/Fo A F nm
46
Fluorescenční rezonanční transfer energie
t – doba života exc. stavu J – překryvový integrál n – refraktivní index rozpuštědla n – vlnočet emise donoru = Ro6/(Ro6 + R6) Ro6 = , t.J/n2no2
47
Fluorescenční rezonanční transfer energie
Použití – změření vzdálenosti mezi dvěma molekulami v bílkovině Tryptofan (290/340) vs. NADH (340/450 nm)
48
Fluorescenční rezonanční transfer energie
49
Fluorescenční anizotropie
50
Fluorescenční anizotropie
Polarizační filtry
51
Fluorescenční anizotropie
52
Fluorescenční anizotropie
53
Fluorescenční anizotropie
Fluorescenční anizotropie r = Iv – Ih I I = Iv + 2Ih Rotační relaxační čas t, střední doba života fluorescence r, rotační relaxační čas molekuly ro – anizotropie nepohyblivé molekuly ro/r = 1 + 3t/r excitace a V objem h viskozita r = Vh/RT ro = (3 cos2a -1)/5 ro/r = 1 + 3tRT/Vh
54
Fluorescenční anizotropie
Využití: Interakce makromolekuly s ligandem F r mg makromolekuly
55
Fluorescenční anizotropie
Využití: Měření viskozity prostředí ro/r = 1 + 3tRT/Vh ro/r = 1 + K/h h = 2,4r/(0,362 – r) r Fl. anizotropie DPHT Vázaného v liposomech DPPC °C
56
Chemiluminiscence Luminol
57
Chemiluminiscence Luciferin
58
Chemiluminiscence Aequorin – Aequoria victoria
59
Chemiluminiscence Aequorin – Aequoria victoria
60
Chemiluminiscence Aequorin – Aequoria victoria
Průnik vápníku do mitochondrií Aktivuje oxidaci
Podobné prezentace
© 2024 SlidePlayer.cz Inc.
All rights reserved.