Laboratoř Oční kliniky VFN a 1. LF UK Kateřina Jirsová Oční Tkáňová Banka VFN a 1. LF UK.

Prezentace na téma: "Laboratoř Oční kliniky VFN a 1. LF UK Kateřina Jirsová Oční Tkáňová Banka VFN a 1. LF UK."— Transkript prezentace:

1 Laboratoř Oční kliniky VFN a 1. LF UK Kateřina Jirsová Oční Tkáňová Banka VFN a 1. LF UK

2 laboratoř Oční kliniky OTB 1.získávání, příprava tkání pro transpl. účely 2.použití tkání - transplantace 1.diagnostika a výzkum 2.metody

3 OTB: získávání, příprava, uchovávání a distribuce tkání pro transplantace v očním lékařství TKÁNĚ: oční: rohovka celý bulbus skléra limbální buňky (kultivace) jiné: amnion

4 IDEÁLNÍ ROHOVKA PRO TRANSPLANTACI nesmí být zdrojem kontaminace (ba, viry, priony) zdravá, bez mechanických, degenerativních, či jiných poškození kvalita endotelu - počet buněk (min. 2000 buněk na mm 2 ) refrakčně vhodná bez antigen-prezentujících buněk HLA typizovaná neztluštělá (bez edému)

5 v médiích vlhká komůrka kryo- konzervace hypotermie tkáňová kultura USAEvropa 4°C-197 °C4 °C31- 37°C  48 h (24) roky  14 d (3 – 7)  36 d OTB MOŽNOSTI UCHOVÁVÁNÍ ROHOVEK

6 kadaverózní tkáň -do 80l, 24 h p.m., -nesouhlas s odběrem -neznámá příčina smrti kontraindikace -aktivní syst. infekce -neurodegener. onemocnění -lymfomy, leukémie -oční onemocnění, chirurgie -intoxikace 1. ODBĚR TKÁNĚ Enukleace Excize in situ orgánové x tkáňové odběry živí x zemřelí: HB, NHB

7 2. MIKROBIOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ  HIV 1, 2  Hepatitis B  Hepatitis C  Syphilis CMV, HTLV, EBV

8 3. REGISTRACE TKÁNĚ evidence archivace přidělení kódu vložení do databáze

9 Makroskopické hodnoceníBiomikroskopie Vyřazeny bulby: -rohovky abnorm. tvaru -cizí těleso, nečistoty -stromální zákaly -známky chir. zákroků - výrazné defekty epitelu -jizvy -známky patolog. stavů 4. HODNOCENÍ TKÁNĚ

10 5. DEKONTAMINACE oplach ultračisou vodou PVP-jód thiosíran Na + PBS (fosfátový pufr) 6. PREPARACE

11 7. MIKROSKOPICKÉ HODNOCENÍ trypanová modř (0.15%, 90s), sacharóza – hypotonický roztok (0.9 and 1.8%, 2 min), fosfátový pufr

12 Rohovka – anatomie, funkce ENDOTEL 1 buněčná vrstva (bariéra) 6000bek/mm2 při narození  3500/5l c postmitotický (G1)  0.6%  /rok  (2300/80l) sekrece kolagenu Na/K ATPáza permeabilita, živiny pro stro, ZO STROMA transparence (paralel. uspořádání vláken kolagenu), KC- MFB,FB + DC DESCEMETOVA MEMBR. (BM endo,kolagen IV, VIII) BAWMANNOVA MEMBR. (kolagen) EPITEL 5 vrstev bek: bazální (1) kubické (2-3) + LC povrchové ploché (2)+N 43 D

13 Hodnocení endotelu mrtvé buňky: do 5% počet/mm 2 :  2 300 polymegatismus: odchylky ve velikosti pleomorfismus: odchylky od

14 9.TRANSPLANTACE diagnózy: keratokonus perforace roh. vředu bulózní keratopatie dystrofie (Fuchsova, makulární, PPCD) leukom rekeratoplastiky 8.UVOLNĚNÍ A DISTRIBUCE TKÁNĚ rizikové faktory: vaskularizace přítomnost srůstů glaukom, uveitida opakovaná KP velikost transplantátu inkomp. HLA, ABO diagnóza další chirurgie

15 9.TRANSPLANTACE rizika primární selhání infekce obnovení choroby rejekční reakce rejekce pomalá dekompenzace keratolýza výhody imunologické privilégium bez krevního a lymf. zás. nízký počet APC exprese (FasL) epitelem a endotelem transplantátu přítomnost TGF β v komorové tekutině molekuly s výraznými imunomodulačními účinky, ( α-MSH, VIP, somatostatin, trombospondin 1)

16 TSE, PRIONOVÁ ONEMOCNĚNÍ patolog.prion - protein, který přestal být proteinem (konformační změna) Creutzfeld-Jakobova choroba: c x nv Gerstmann-Sträussler-Scheinkerova choroba fatální familiární insomnie kuru normální prion PrP C x patol. PrP P (PrP SC, PrP BSE, PrP CJD ) PrP C PrP P konf. z.shlukování geneticky, spont. mutace, inokulace amyloid

17 Lidský amnion, HAM (human amnion membrane) vlastnosti podpora epitelizace  migrace,  adheze,  diferenciace,  apoptózy antiinfekční (inh. proteáz, MMP, cystatin E) inhibice fibrózy anatomická bariéra inhibice vaskularizace cytoprotektivní (hsp) použití defekty epitelu povrchu oka (Stevensův-Johnsonův sy, bulózní kertatopatie, nekrotizující keratitidy, OCP, poleptání, ulcerace rohovky....) rekonstrukce povrchu oka lokální terapie

18 Preparace HAM 1.oplach amnionu pufrem (odstranění krve) 2.nastřižení kolem pupečníku, tupá preparace amnionu 3.natažení amnionu na Petriho misku (epitelem nahoru) 4.oplach pufrem, vyhlazení AM 5.přenesení na NC membránu (epitelem nahoru) 6.vystřihání 2x2, 3x4cm čtverců 7.přenesení do skladovací nádobky -z placenty po císařském řezu -zpracování semisterilně - sterilně -odběr pupečníkové krve

19 Laboratoř Oční kliniky diagnosticko-léčebná syndrom suchého oka (kvalitativní) selhání limbálních kmenových buněk OCP příprava autologního séra dg.virových onemocnění výzkum molekulární a buněčné mechanismy rejekce allo i xenotransplantátů (zvířecí model) molekulární a buněčná charakterizace rohovkových dystrofií (PPCD) charakterizace hadovitého chromatinu METODY buněčné: mikroskopie, tkáňové kultury, imunohistochemie molekulární: PCR, elektroforéza, blotování, ISH

20 ZPRACOVÁNÍ A UCHOVÁVÁNÍ TKÁNÍ (rohovka, prstenec, spojivka, epiretinální membrána, komorová voda) zamrazování (-70°C) přímé zamrazování (KV)  stanovení proteinů v zamrazovacím médiu  krájení  vzorky IHC zalévání do parafínu  krájení  vzorky IHC zalévání do glutaraldehydu  vzorky pro ElMi

21 IMUNOHISTOCHEMIE Secundary

22 IMUNOHISTOCHEMIE OCP – IgA positivity in BM

23 OTISKOVÁ CYTOLOGIE SPOJIVKY (ROHOVKY) - jednoduchá, neinvazivní, netraumatizující metoda pro vyšetření povrchové vrstvy tkáně přilnavost povrchové vrstvy buněk na vhodný materiál zpracování vzorku (fixace, barvení) hodnocení Využití Screaning (pooperační změny, změny léčby) Diagnóza (selhání limbálních kmenových buněk)

24 Hodnocení squamózní metaplázie vrstevnatý sekr. n. nesekr. epitel  epitel nesekretující keratinizující, + abnormální diferenciace epitelu Stupeň 0:Normální spojivkový epitel Stupeň 1:Úbytek pohárk. buněk, bez keratinizace Stupeň 2:Ztráta pohárk. buněk, náznaky keratinizace Stupeň 3:Časná keratinizace Stupeň 4:Střední keratinizace Stupeň 5:Pokročilá keratinizace

25 Selhání limbálních kmenových buněk, LSCD Limbální kmenové bky: lokalizace: bazální vrstva epi limbu, pomalu dělící se bky, po stimulaci vysoká mitot. aktivita, posunují se z limbu do bazální vrstvy epitelu rohovky, stoupají do povrchových vrstev za současné diferenciace limbus – pozitivní negativní rohovka – negativní pozitivní CK 19 CK 3

26 vede k přerůstání spojivkového epitelu přes rohovku (nahrazení rohovkového epitelu spojivkovým)  povrchová vaskularizace rohovky, destrukce bazální membrány rohovky, chron. zánětlivá infiltrace Selhání limbálních kmenových buněk, LSCD rohovka povrchová vrstva epitelu spojivka