„AFLP, amplified fragment length polymorphism“

Prezentace na téma: "„AFLP, amplified fragment length polymorphism“"— Transkript prezentace:

1 „AFLP, amplified fragment length polymorphism“
Alternativa k RAPD na bázi DNA fingerprintingu nabízí metoda AFLP (česky polymorfismus délek amplifikovaných fragmentů) (Vos et al. 1995) Multilokusová analýza AFLP má mnohem vyšší schopnost rozlišení polymorfismu alel než metoda RFLP (Barker et al. 1999) a je velmi vhodnou technikou pro studium genetické variability na úrovni druhů či populací u široké škálu organismů (např. Liu et al. 1998, Wang et al. 2004, Uthicke et Conand 2005) možnost rychle vygenerovat velké množství polymorfních markerů i u druhů, o nichž nemáme jedinou předchozí genetickou informaci Princip metody: technika AFLP kombinuje výhody osvědčeného principu PCR (polymerase chain reaction) a štěpení restrikční endonukleázou pro získání specifických selektovaných restrikčních fragmentů celkové DNA jakéhokoli jedince, tedy napříč genomem, za vysoké míry opakovatelnosti pokusu. „nevýhody“: dominantní marker s občas nejistým původem a homologií fragmentů, finančně dražší metoda, komplikovanější protokol

2 „AFLP, amplified fragment length polymorphism“
Využití vhodnost AFLP markerů při studiu hybridizace, introgrese, definice klonů, polyploidů, stanovení genotypu (vyšší variabilita oproti konzervativním alozymovým lokusům) určování paternity díky variabilitě a vysoké míře reprodukovatelnosti výsledků systematika, fylogeneze, fylogeografie populačně-genetické studie: vnitro- a mezipopulační variabilita, kvantifikace genového toku, podobnost/rozdílnost mezi populacemi AFLP protokol na: (Projekt FRVŠ 813/2008)

3 AFLP, princip metody 1. restrikce: specifické rozštěpení celkové DNA dvěma restrikčními endonukleázami: MseI - rozpoznává 4bp dlouhou sekvenci (TTAA) a EcoRI rozpoznává 6bp (GAATTC) velké množství fragmentů, mají na jednom konci MseI a na druhém EcoRI štěpné místo 2. ligace: T4 ligázou jsou k fragmentům připojeny specifické adaptory, tím známe sekvence začátků a konců všech fragmentů 3. preselektivní amplifikace: redukce vysokého počtu fragmentů, PCR s primery komplementární adaptorům, avšak o 1 bázi delší a přesahují tak "dovnitř" studovaného fragmentu, namnoží se tak pouze 1/4 všech fragmentů (pouze ty s komplementární bázi), tj. se 2 primery je amplifikována pouze 1/16 fragmentů (1/4 x 1/4) 4. selektivní amplifikace: další redukce s primery se třemi selektivními nukleotidy (přesahy "dovnitř" studovaných fragmenty, amplifikována je pouze 1/256 všech fragmentů (1/16 x 1/16) převedení na 0-1 matici (presence/absence fragmentu), výpočet párových koeficientů genetické vzdálenosti (Nei, Jaccard...), konstrukce stromu pomocí UPGMA, neigbour-joining.....     5. visualizace a vyhodnocení: s flourescenčně značeným EcoRI primerem můžeme k vyhodnocení fragmentů využít automatický sekvenátor