Metody imunodifuze a precipitace v gelech

Prezentace na téma: "Metody imunodifuze a precipitace v gelech"— Transkript prezentace:

1 Metody imunodifuze a precipitace v gelech
Jana Novotná

2 Imunoprecipitační reakce v gelech
Dvojitá difúze ve dvou směrech

3 Antigeny, jejich vlastnosti a složení
Imunogenicita - imunitní odpověď specificky namířená proti antigenu. Antigenní specifita – schopnost molekuly antigenu (nebo její části) reagovat se specifickou protilátkou. Antigenicita – dána povrchovou strukturou imunogenu – antigenními determinantami (ovalbumin, MH , má 5 antigenních determinant a thyroglobulin, MH , více než 40). Organismus reaguje jen na ty, které jsou mu cizí. Haptény – antigenní determinanty, samy o sobě neschopné vyvolat imunitní odpověď. Stanou se imunogenní navázané na bílkovinný nosič.

4 Antigeny, jejich vlastnosti a složení
Chemické složení antigenů: bílkoviny polysacharidy lipopolysacharidy nukleoproteiny glykoproteiny steroidní hormony bakteriální a živočišné buňky, viry syntetické polypeptidy syntetické polymery

5 Protilátky (imunoglobuliny) a jejich složení
Bílkoviny se specifickou vazebnou aktivitou vůči antigenu (antigenní determinantě), na jejichž podnět se vytvořily. Chemická povaha - imunoglobuliny

6 Protilátky (imunoglobuliny) a jejich složení
Počet různých specifických protilátek - > 104. Imunoglobuliny - ~ 20% plasmatických bílkovin. Vazebné místo – 5% molekuly protilátky, rozlišuje velmi jemné rozdíly v antigenních determinantách. Struktura vazebného místa je přesně komplementární k antigenní determinantě (zámek a klíč), asi 3 aminokyselinové zbytky.

7 Protilátky (imunoglobuliny) a jejich složení
Variabilita protilátek podmíněna 5ti třídami Ig: G, A, M, D, E Těžké řetězce – g, a, m, d, e Lehké řetězce – k, l Jejich podtřídami řetězců: IgG – g1, g2, g3, g4 IgA – a1, a2 IgM - m1, m2

8 Podstata vazeb antigen protilátka
Síly elektrostatické - opačně nabité skupiny (-NH3+) – lysin, (-COO-) – k. asparagová) Vodíkové vazby (slabé reversibilní vodíkové můstky) Hydrofobní interakce (postranní řetězce nepolárních aminokyselin – Val, Leu, Ile, Phe) Van der Waalsovy síly (elektrony vnějších orbitů dvou makromolekul)

9 Afinita protilátky k2 Pl + Ag  PlAg k1 K = = [PlAg] k1 k2 [Pl] [Ag]
Rovnovážná konstanta k2 [Pl] [Ag]

10 Imunoprecipitační reakce
Slouží ke kvalitativní a kvantitativní detekci antigenů a protilátek: Fáze první – vznik primárních komplexů o nižší M.H. Fáze druhá – vzájemné propojení Ag a Pl do trojrozměrné mřížkovité struktury (vznik nerozpustných agregátů)

11 Poměr antigen/protilátka
Prozóna : nadbytek Pl, nevytváří se precipitát (rozpustné imunokomplexy) Zóna ekvivalence- optimální poměr Ag/Pl - precipitát Post-zóna - nadbytek Ag (imunokomplexy se rozpadají)

12 Imunoprecipitační reakce v gelech
Zakládají se na různé rychlosti difúze Ag a PL do gelu v závislosti na: jejich koncentraci fyzikálně chemických vlastnostech struktuře a vlastnostech gelu Nejužívanější gely – agar a agaróza

13 Imunoprecipitační reakce v gelech
Jednoduchá difúze v jednom směru - difúze antigenu do gelu s protilátkou - difúze protilátky do gelu s antigenem

14 Imunoprecipitační reakce v gelech
Dvojitá difúze ve dvou směrech (metoda Ouchterlonyho)

15 Imunoprecipitační reakce v gelech
Dvojitá difúze ve dvou směrech

16 Imunoprecipitační reakce v gelech
Kvantifikace: antigenu protilátky

17 Imunoprecipitační reakce v gelech
Jednoduchá radiální difúze

18 Imunoprecipitační reakce v gelech
Imunoelektroforéza – kombinuje separaci bílkovin ve směsi pomocí elektroforézy v agarovém gelu na jednotlivé frakce s imunodifúzí a precipitací. Plasma (směs antigenů) Elektroforéza Antisérum (směs protilátek) Imunodifúze

19 Imunoprecipitační reakce v gelech

20 Imunoprecipitační reakce v gelech
Raketková imunoelektroforéza: Antigen pomocí elektroforézy migruje do gelu, který obsahuje protilátku. Výška raketky odpovídá koncentraci antigenu.