Western blotting slouží pro identifikaci polypeptidů prostřednictvím protilátek obvykle následuje po rozdělení polypeptidů v elektrickém poli polyakrylamidovou.

Prezentace na téma: "Western blotting slouží pro identifikaci polypeptidů prostřednictvím protilátek obvykle následuje po rozdělení polypeptidů v elektrickém poli polyakrylamidovou."— Transkript prezentace:

1 Western blotting slouží pro identifikaci polypeptidů prostřednictvím protilátek obvykle následuje po rozdělení polypeptidů v elektrickém poli polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (PAGE)

2

3 Elektroforéza pohyb nabitých částic v elektrickém poli
používají se alkalické pufry, které proteinům udílejí negativní náboj – v elektrickém poli pohyb směrem k anodě

4 Gelová elektroforéza Gelová elektroforéza je všestrannější než běžně používané - papírová nebo celulosaacetátová elektroforéza. Provádí se převážně na podle účelu preferován polyakrylamidový nebo agarosový gel. Při přípravě gelu je možné ovlivňovat stupeň polymerace (zesíťování) - tedy velikost pórů. U gelů s velmi velkými póry lze docílit stavu podobnému volné elektroforéze v roztoku, u malých pórů se uplatňuje efekt gelové filtrace. Do jisté míry i iontoměničové efekty, lze využít ke zlepšení dělení (afinitní elfo, imunoelektroforéza).

5 Polymerace akrylamidu
Smísením roztoku monomeru a dimeru (bis-akrylamidu). Pozor jde o látky škodlivé zdraví. Akrylamid je karcinogenní a neurotoxický s kumulativním účinkem. Radikálová polymerace iniciátorem je persíran amonný (peroxodisulfát (NH4)2S2O8), katalyzátorem je N, N,N´,N´-tetramethylendiamin (TEMED). Tyto látky lze ve funkci nahradit riboflavinem za přítomnosti světla a malého množství kyslíku. Inhibitory polymerace jsou kyslík (O2) v nadbytku, látky s SH- skupinami. Koncentrace monomeru ovlivňuje délku řetězců, obsah dimeru stupeň zesíťování.

6 Polyakrylamidový gel - příprava
PAGE - elfo v polyakrylamidovém gelu

7 Provedení PAGE Nejčastěji se PAGE provádí ve vertikálním uspořádání, i když běžně i v horizontálním (použití tzv.“precast“ gelů). Podle tvaru rozlišujeme trubičkové gely („tube gels“) a deskové gely („slab gels“). Trubičkové gely se připravují ve skleněných trubičkách, slab gely se nalévají mezi plochá skla oddělená vymezovači tzv. spacery, tím se volí tloušťka gelu. Jamky pro vzorky se tvoří hřebínkem („comb“). Trubičové jsou obvykle v rozměrech x 15 cm, deskové gely od minigelů (4 x 5 cm) po sekvenační gely (20-30 x cm s tloušťkou mezi 0.05 a 1.5 mm).

8 Aparatury pro deskové gely

9

10 SDS-PAGE Pohyblivost proteinů v gelu při nativní elektroforéze ovlivněna - tvarem (globulární, vláknité) - hustotou náboje - velikostí SDS-PAGE – denaturační varianta - proteiny se před nanesením na gel denaturují detergentem SDS (laurylsíran sodný) - disulfidové vazby se eliminují redukčním činidlem β-mercaptoethanol - denaturace je dokončena krátkým varem - SDS - obklopí protein – záporný náboj – odpuzování – natažení molekuly - počet molekul SDS navázaných na protein je zhruba úměrný jeho molekulové hmotnosti – každý protein má za přítomnosti SDS ekvivalentní hustotu náboje - jediným faktorem, který ovlivňuje pohyblivost proteinů v gelu při SDS PAGE je molekulová hmotnost

11 Elektroblotting přenos proteinů rozdělených v gelu na pevnou membránu
membrány - PVDF (polyvinylidendifluorid) – vyšší vazebná kapacita - nitrocelulóza hnací silou je elektrické pole – kolmé k el. poli použitém při elektroforéze - proteiny nabity záporně – pohyb směrem ke kladné elektrodě (anodě) dělení - tankový (wet) blotting - polosuchý (semi-dry) blotting

12 Imunodetekce detekce proteinů pomocí specifické protilátky
před vlastní imunodetekcí je membrána blokována - zabránění nespecifickým interakcím mezi membránou a protilátkou - redukce pozadí - roztok hovězího sérového albuminu (BSA) nebo ředěné odtučněné mléko (unfatty dry milk) Primární protilátky monoklonální - protilátky produkované jen jedním určitým klonem B- lymfocytů - specifické pro jeden jediný epitop - produkce – hybridomy (fúze maligních myelomových buněk a zdravých lymfocytů produkujích Ab) polyklonální - produkované po opakované imunizaci zvířete, jeho krev využita jako zdroj protilátek - imunoglobuliny jsou produkty různých klonů B-lymfocytů

13 Membrána je inkubována s primární protilátkou specifickou pro daný protein.
Protilátka je ředěna v pufru, který obsahuje nosič a detergent optimální koncentrace primární protilátky je stanovena vyzkoušením různých ředění Sekundární protilátky po inkubaci s primární protilátkou je membrána opláchnuta (odstraněny zbytky nenavázané primární protilátky) sekundární protilátka specificky rozpoznává daný typ primární protilátky sekundární protilátka je značena většinou enzymem (nebo radioaktivní sondou), který po reakci s příslušným substrátem produkuje barevný produkt, fluorescenci nebo světlo Chemiluminisceční reakce – HRP (horseradish peroxidase, křenová peroxidáza) - HRP oxiduje specifický substrát – emitované světlo detekováno pomocí fotografického filmu

14

15

16 Literatura Molecular Biology of The Cell
Principles and Techniques of Practical Biochemistry Metody molekulární biologie