Epigenetika - RNA interference

Prezentace na téma: "Epigenetika - RNA interference"— Transkript prezentace:

1 Epigenetika - RNA interference

2 Objev RNA interference (1998)
- umlčování exprese genů dvojvláknovou RNA Cenorhabditis elegans

3 Antisense RNA (= RNA komplementární k mRNA) umlčuje expresi
(již počátek 80. let 20. století) určitý gen je možné umlčet vnesením antisense RNA (nebo přepisem genu v opačné orientaci) na základě komplementarity dochází ke spojení mRNA a antisense RNA, k tvorbě dsRNA

4 Jak antisense RNA umlčuje expresi?
Původní (!) hypotézy: - antisense RNA mechanicky brání translaci - dsRNA (vč. mRNA) je degradována (RNázami)

5 Cíl: zvýšení exprese genu pro enzym syntézy pigmentu
Kosuprese u Petůnie Cíl: zvýšení exprese genu pro enzym syntézy pigmentu Výsledek: ztráta pigmentace v částech květu Napoli et al Plant Cell 2:279–289

6 Kosuprese u Petůnie Mechanismus kosuprese?
Exprese antisense RNA méně účinná Napoli et al Plant Cell 2:279–289 Mechanismus kosuprese?

7 Za co tedy dostali Nobelovku? - dělat kontroly se vyplatí!
vnesení i velmi malého množství dsRNA vede ke specifickému umlčení exprese (antisence RNA není zdaleka tak účinná!) dsRNA tedy musí být signálem k umlčování! Andrew J. Hamilton, David C. Baulcombe*(1999): A Species of Small Antisense RNA in Posttran- scriptional Gene Silencing in Plants

8 RNA interference (RNAi)
= umlčování exprese genů prostřednictvím dsRNA, resp. malých RNA (small RNA, sRNA 21-24(25)nt) + ochrana proti invazním nukleovým kyselinám + role v udržování struktury chromatinu (metylace DNA) „The precise role of 25-nt RNA in PTGS remains to be determined. However, because they are long enough to convey sequence specificity yet small enough to move through plasmodesmata, it is possible that they are components of the systemic signal and specificity determinants of PTGS.“ (Hamilton and Baulcombe 1999)

9 Univerzální kroky RNAi
dsRNA v buňce je štěpena enzymem Dicer(-like) na krátké dsRNA fragmenty – malé RNA (sRNA nt) protein Argonaut s jedním z vláken malé RNA (RISC: RNA induced silencing complex) zprostředkovává rozpoznání komplementárních (cílových) sekvencí

10 Mechanismus účinku malých RNA
Pol V PTGS (posttranscriptional gene silencing ): - specifická degradace transkriptu nebo blokování translace TGS (transcriptional gene silencing ): metylace cytosinů v promotoru (RdDM), heterochromatinizace , bránění vazbě transkripčních faktorů

11 Malé RNA - u rostlin je 3’ konec sRNA metylovaný (HEN1)
miRNA (micro) – z transkriptů RNA Pol II (pre-miRNA) – stovky MIR genů (in trans) siRNA (small interfering) – z dsRNA různého externího i interního původu - tisíce typů (in cis i in trans) pre-miRNA Wang et al. 2004

12 Jak vzniká dsRNA? Sekundární struktury virových RNA (MIR gen) ? RdRP = RNA dependentní RNA polymeráza - syntéza komplement. vlákna templát - transkripty přestřižené RISC - poškozené mRNA (bez polyA či čepičky) - transkripty RNA polymerázy IV Štěpení Ago (sekundární siRNA )

13 Dicer-like - štěpení dsRNA (21-24nt) v Arabidopsis 4 paralogy
(různé funkce) DCL1 – pre-miRNA (21,22 nt miRNA), siRNA z vlásenek DCL3 – tvorba 24 nt siRNA pro TGS (RdDM) DCL2, 4 – protivirová obrana a sekundární siRNA (21-22 nt)

14 Argonaute RNA binding protein (20-26 nt RNA) - výběr vlákna (5’ nt, účast HSP90) - u Arabidopsis 10 genů - součást RISC: blokování translace nebo slicer (RNAse H-like endonuclease – PIWI doména) - účast při TGS (RdDM) (RNA directed DNA methylation)

15 Mechanismus účinku malých RNA
závisí mj. na míře komplementarity - nekomplementarita v místě štěpení brání RNázové aktivitě

16 RNA polymerázy v RNAi RNA dependentní RNA polymerázy (RdRP, RDR) RDR6:
- nutné pro tvorbu většiny siRNA RDR6: - tvorba dsRNA na „divných“ RNA (bez polyA, bez čepičky) - tvorba dsRNA z produktů štěpení Ago = sekundární siRNA (primární siRNA – při jejich vzniku se neúčastní sRNA) - blízký homolog RDR1 – především v protivirové obraně RDR2: tvorba dsRNA na produktech RNA polymerázy IV

17 RNA polymerázy v RNAi DNA dependentní RNA polymerázy (Pol IV a Pol V)
- příbuzné RNA polymeráze II (sdílejí řadu podjednotek) - rostlinně specifické RNA polymeráza IV - transkripce oblastí s H3K9me2 a nemetyl. H3K4 (SHH1) - krátké transkripty (stovky nt), s čepičkou, bez polyA - přepisovány RDR2  dsRNA  DCL3  siRNA RdDM RNA polymeráza V - transkripce nutná pro metylaci DNA řízenou malými RNA (RdDM) - přímá vazba AGO4(2,6,9) pro rozpoznání cíl. sekvence RNA polymeráza II – mechanismus nejasný

18 RNA directed DNA methylation
SHH1 SHH1 Zhang et al. 2013 Pol IV a V – RNA polymerázy RDR2 - RNA dep.RNA polymeráza DCL3 – dicer-like protein AGO4 – Argonaute DRM2 – de novo metyltransferase DRD1 – chromatin remodelling protein SHH1 – dual histon-code reading (H3K9me2, H3K4) - metylace (aktivitou DRM2) podmíněna interakcí AGO-siRNA s RNA Pol V (C-terminální doména velké podjednotky)

19 RNA directed DNA metylation
de novo metylace transpozónů v nových místech inzerce metylace v případech, kde přenos informace (CMT2/3) z metylace histonu nemusí být spolehlivý (málo nukleozómů?) SHH1 Zhang et al. 2013 Zemach et al. 2013

20 RdDM – role Polymerázy II
- nutná k metylaci některých sekvencí - napomáhá funkci Pol V (nebo jí nahrazuje)? - navádí Pol IV? - tvoří nekódující transkripty pro amplifikaci siRNA

21 Tvorba sekundárních siRNA
- cílová RNA (mRNA, virová RNA, TAS transkript) štěpena za účasti primární sRNA (miRNA či siRNA) - RDR6 – syntéza komplementárního vlákna k rozštěpené RNA: dsRNA  DCL2(4)  sekundární siRNA sekundární siRNA amplifikace signálu tvorba siRNA z přilehlých sekvencí (transitivita) jiné cílové molekuly – př. ta-siRNA (miRNA na TAS transkript) (trans-acting siRNA – rozšíření záběru miRNA)

22 Kosuprese u Petůnie dsRNA
- zvýšení exprese genu pro enzym syntézy pigmentu nečekaně způsobilo ztrátu pigmentace v částech květu dsRNA K aberantním („podezřelým“) transkriptům vytváří RdRP (RDR6; = RNA dependentní RNA polymeráza) komplementární vlákno - ze vzniklé dsRNA se tvoří malé RNA, které blokují expresi příslušného genu (transgenu in cis a interního rostlinného genu in trans) Praktické využití při funkčních analýzách genů (modulaci exprese) – overexprese i knock-out jedním konstruktem!

23 paramutagenní a paramutovatelná alela
Paramutace interakce (in trans) mezi homologními alelami (epialelami), která vede k dědičné změně v genové expresi jedné z alel (epimutaci) paramutagenní a paramutovatelná alela Mechanismus?

24 paramutovatelná alela
Paramutace interakce (in trans) mezi homologními alelami (epialelami), která vede k dědičné změně v genové expresi paramutovatelné alely paramutagenní alela paramutovatelná alela metylovaná, transkripčně neaktivní alela je přepisována Pol IV - z jejích transkriptů vznikají siRNA, které mohou měnit epigenetický stav (metylaci) u homologních sekvencí MOP1 = homolog RDR2 MOP2 = podj. Pol IV a V (mediator of paramutation)

25 Dráhy RNAi u rostlin - přehled
a b c d + Inverted repeat Natural antisense (DNA methylation) Molnár et al. 2011 + sekundární siRNA (z jakéhokoli transkriptu štěpeného primární sRNA)

26 Tvorba siRNA z dsRNA není rovnoměrná
- liší se místem, velikostí, výběrem vlákna, … - závisí na primárním spouštěči - převaha sense-spec. siRNA Roub s primární tvorbou siRNA Podnož (netransformovaná) sekundární siRNA (vzniklé transitivitou): štěpení mRNA - AGO1-siRNA, RDR6, DCL(4)

27 nově se tvořící listy jsou odolné
Systémová rezistence nově se tvořící listy jsou odolné vůči virové infekci (1928) Mechanismus?

28 - floémem (= pasivně ve směru toku)
Šíření umlčujícího signálu - plasmodesmy - floémem (= pasivně ve směru toku) - siRNA i miRNA, 24 nt jistě (ale pravděpodobně i 21 nt)

29 Vizualizace šíření umlčování
- umlčování GFP mobilním signálem (od cévních svazků) umlčování exprese GFP - zelená fl., červená = autofluorescence chlorofylu

30 Funkce RNAi a šíření sRNA
na dlouhé vzdálenosti - protivirová obrana - bránění nové infekci či šíření infekce - obrana proti transpozónům – udržování heterochromatinu - regulace vývojových procesů - prakticky všech - regulace exprese v odpovědi na stres - regulace získávání živin - regulace příjmu (např. fosfor) - epigenetická modulace genetické informace v meristému (dědičné změny) - v environmentálních dědičných (!) adaptacích (Lamarckismus)

31 Epigenetická regulace genové exprese
ve vývoji rostlin regulace především prostřednictvím miRNA (21 nt) (kódované jako pri-miRNA - štěpeny DCL1) - u Arabidopsis stovky MIR genů někdy zprostředkováno ta-siRNA - nekódující TAS transkript (štěpený v důsledku nasednutí RISC s miRNA, RDR6, …) - často šíření mezi sousedícími buňkami (non-cell autonomous) cílem jsou zpravidla geny pro regulační proteiny např. transkripční faktory, komponenty ubiquitinační dráhy, … (omezená spolehlivost výsledků z promotorových fúzí bez transkriptu zkoumaného genu!)

32 př. úloha miRNA a ta-siRNA ve vývoji listu Arabidopsis
Pulido A , Laufs P J. Exp. Bot. 2010;61:

33 př. ustavení polarity listu – gradient ta-siRNA
Arabidopsis: - gradient dán místem exprese TAS3 a AGO7 Kukuřice: miR390 Pulido A , Laufs P J. Exp. Bot. 2010;61:

34 Epigenetická regulace genové exprese
ve vývoji rostlin Fenotypové změny navozené expresí miRNA-resistentních variant cílových genů (stejný protein, jiná nukleotidová sekvence) Fenotypové změny navozené potlačením exprese určité miRNA

35 Parentální imprinting
odlišná epigenetická modifikace (rodičovský vtisk) alel děděných od jednotlivých rodičů (vede k jejich odlišné expresi po splynutí gamet) = alela určitého genu je u jedné z gamet metylována paralelně vytvořeno u savců a krytosemenných rostlin vyvolává „hemizygotní“ stav a může sloužit pro zajištění přiměřené a vyrovnané výživy embryí, které se vyvíjejí v rámci mateřského organismu (= obrana proti vzniku paternálních alel vedoucích k nadměrné výživě embrya) - u krytosemenných rostlin význam v determinaci velikosti endospermu

36 Parentální imprinting
imprint se ustavuje v průběhu meiozy (savci) či při vývoji gametofytu (rostliny) u savců v průběhu gametogeneze dochází k celkové demetylaci (resetu) a následné metylaci vybraných genů v závislosti na pohlaví u rostlin dochází k (rozsáhlejší) demetylaci jen v části gametofytu – v jeho „geneticky terminálních buň. liniích“: - v centrální buňce zárodečného vaku (DME - DEMETER) - ve vegetativním jádře pylové láčky (blokování DDM1, DME) Funkce: regulace velikosti endospermu (vlastní imprinting) spolehlivé umlčení TE v gametách (paralelní epigenetický proces)

37 Epigenetické změny při vývoji pylu
inhibici metylace (represe DDM1) ve vegetativním jádře pylové láčky, i aktivně DME Primární účel: zřejmě pojištění správné metylace TE v generativních buňkách (spermatických buňkách): Demetylace – reaktivace TE – tvorba siRNA – transport do spermatických buněk – podpoření správné metylace TE

38 Epigenetické změny při vývoji
zárodečného vaku Primární účel: blokování TE (a endospermově spec. genů) regulace velikosti endospermu blokování gametofytického vývojového programu – umožnění vývoje embrya?

39 Represe exprese genů nezávislá na metylaci DNA a sRNA:
Proteiny PcG (POLYCOMB GROUP) - reprimovaný stav je udržován primárně di-(tri-)metylací histonu H3K27 - v růžici Arabidopsis asi 4 – 5 tis. genů! - udržování H3K27me2 zprostředkováno přítomností genově specifického Polycomb repressive complexu (PRC2) - udržování metylace histonu po replikaci

40 př. vernalizace VRN2 (VERNALIZATION) PcG protein se váže po proběhlé vernalizaci spolu s dalšími faktory na promotor genu FLC, který brání kvetení v juvenilním stavu (navodí represi prostřednictvím H3K27me2) represe FLC dovolí přejít do generativní fáze VIN3 – deacetylace histonů, VRN2 – vazba a indukce metylace histonu H3K27

41 Vernalizace – primární signál?
VIN3 chromatin: - stále represivní H3K27me3 (PRC2) - transkripcí vložení aktivační H3K36me3 a acetylace (? indukce rozpadem nukleozómu v místě počátku transkripce – teplotou?) - bivalentní značení chromatinu ( živočišné kmenové buňky) - kvantitativní odpověď

42

43 Prokázané formy mobilního umlčujícího signálu
- na dlouhé vzdálenosti zatím 21nt miRNA a 24nt siRNA ?

44 Overview of miRNA-Mediated Gene Silencing.
Pri-miRNAs are processed in the nucleus and mature miRNAs are exported to the cytoplasm. miRNAs are incorporated into AGO proteins and mediate posttranscriptional gene silencing through slicing or translational inhibition or alternatively through DNA methylation.... Rogers and Chen 2013