Světelná mikroskopie a kontrastní metody

Prezentace na téma: "Světelná mikroskopie a kontrastní metody"— Transkript prezentace:

1 Světelná mikroskopie a kontrastní metody
Kdy se poprvé objevují čočky? Kdy se tedy poprvé objevují brýle (či jejich předchůdci)? Tuto otázku není snadné zodpovědět, nicméně při archeologickém průzkumu ve staroasyrském Nimrudu byl nalezen krystal známý jako Lanyardova čočka (datovaná do let př.n.l,), artefakty připomínající čočky a jejich využití např pro zapalování rituálních ohňů se někdy datují do doby kolem roku 2000 př. n. l. Z doby kolem roku 0 n. l. je pak znám případ římského krutovládce Nera, který si prý kvůli svému špatnému zraku přidržoval před okem vyleštěný smaragd. Podle zabarvení a optických vlastností však odborná veřejnost soudí, že se spíše jednalo o ochranu zraku před světlem, než o opravdovou korekci. Nicméně, první pár čoček, zasazený do obrouček, tedy první opravdový předchůdce našich dnešních brýlí, byl poprvé použit (pravděpodobně) ve staré Číně někdy v 10. století. V Evropě se brýle jako takové poprvé objevují na konci století třináctého v italské Florencii - mužem, který je jako první zpopularizoval mezi florentskou aristokracií, byl jistý Salvino degli Armati. Prvním učencem, který brýle popsal a doporučil k užívání, byl pak anglický myslitel a filozof Roger Bacon. Tehdy se již začínají objevovat i první zmínky o korekci na dálku. Kolem roku 1600 byly vyrobeny optické přístroje s několika čočkami. je nemožné říci, kdo vynalezl složený mikroskop. Holandští výrobci brýlí Hans Janssen a jeho syn Zacharias Janssen se často označují za vynálezce prvního složeného mikroskopu (1590). Je těžké říci, jak moc je to věrohodné, neboť se jednalo o prohlášení samotného Zachariase, které učinil v polovině 17. století. Uvedené datum je nepravděpodobné, protože se dokázalo, že Zacharias Janssen se vlastně narodil kolem roku Dalším adeptem na titul "vynálezce mikroskopu" byl Galileo Galilei. Vyvinul "occhiolino" nebo-li složený mikroskop s konvexní a konkávní čočkou (1609). Galileův mikroskop se stal slavným zejména v "Lynx academy" založené Federicem Cecim v roce Kresby tří včel od Francesca Stellutiho byly součástí pečeti papeže Urbana VIII. a počítají se jako první publikované mikroskopické obrázky (viz Stephan Jay Gould, The Lying stones of Marrakech, 2000). Christiaan Huygens, další Holanďan, vyvinul v pozdním 17. století jednoduchý dvojčočkový systém, jež byl achromaticky korigován. Toto představovalo ohromný skok kupředu. Huygensův okulár se vyrábí dodnes, naneštestí má několik nevýhod, jako je malá velikost pole a oko pozorovatele je nepříjemně blízko ve srovnání s moderními okuláry s širokým polem. Anton van Leeuwenhoek ( ) se často označuje za toho, kdo poprvé použil mikroskopie v biologii, ačkoli jednoduché zvětšovací lupy byly známé již od roku 1500 a zvětšující účinky vodou naplněné skleněné láhve již popsal Seneca ve Starověkém Římě. Van Leeuwenhoekův doma vyrobený mikroskop byl vlastně velmi malým a jednoduchým zařízením s jedinou velmi silnou čočkou. Toto zařízení bylo velmi těžkopádné, ale umožnilo van Leeuwenhoekovi detailní pozorování, převážně proto, že jediná čočka netrpí čočkovými vadami tak výrazně, jako když jsou čočky zdvojené nebo dokonce znásobené jak je tomu u složeného mikroskopu. Dalších 150 let vývoje v oblasti optiky trvalo, než byl složený mikroskop schopný poskytovat obrázky stejné kvality jako van Leeuwenhoekův jednoduchý mikrooskop. Ačkoli se bezpochyby jednalo o velkého nadšence mikroskopie, rozhodně ho nelze označit za vynálezce mikroskopu. Odjakživa chtěli lidé vidět věci mnohem menší, než mohli vnímat pouhým okem

2 Hans a Zacharias Janssenovi
První složený mikroskop zvětšoval 3x při zatažení tubusu a 9x při max. roztažení, měřil 1,2 m Holandský výrobce brýlí Hans Janssen se svým synem Zachariasem Janssenem údajně poprvé zkonstruovali mikroskop složený z více čoček. O vynálezu existuje pouze záznam z pozdější doby v dílech spisovatelů Pierre Borela ( ) a Willema Boreela ( ). Okolo vynálezu mikroskopu existuje mnoho nejasností, obvykle je ale připisován otci a synu Hans a Zacharias Janssenovým, brýlaři z Middleburgu v Holandsku sestavili zvětšovací přístroj, sestávající z trubice se dvěma čočkami na koncích. Byl to první známý složený mikroskop. O vynálezu existuje pouze záznam z pozdější doby v dílech spisovatelů Pierre Borela ( ) a Willema Boreela ( ). 1609 Galileo Galiei ( ) zkonstruoval první mikroskop složený ze spojky a rozptylky, nazval ho occhiolino. Ačkoli mikroskop měl pak několik dalších zlepšovatelů a propagátorů, učenci vytrvale desítky let ke svému bádání používali obyčejnou lupu.

3 1609 Galileo Galilei ( ) zkonstruoval první mikroskop složený ze spojky a rozptylky, nazval ho occhiolino 1619 Cornelius Drebbel ( ) předvedl v Londýně mikroskop založený na dvou spojných čočkách. Nákres mikroskopu se zachoval na zadní straně Drebbelova dopisu králi Jamesovi I.

4 Řecky Micron = malý a scopos = cíl
1625 Giovanni Faber z Bambergu ( ) používá poprvé slovo mikroskop odvozené od slova teleskop Řecky Micron = malý a scopos = cíl

5 Robert Hook 1665 složený mikroskop kniha Micrographia,
sledování tenkých řezů korkem - pojem buňka Toto je složený mikroskop Roberta Hooka. Vynález složeného mikroskop přispěl k obrovskému rozvoji vědy. Právě Angličan Robert Hook pomocí svého složeného mikroskopu, u kterého k osvětlení objektu použil olejovou lampu a tzv. ševcovskou kouli objevil, že živé organismy jsou složeny z buněk – tento termín použit poprvé. Ševcovská koule je naplněná buď vodou nebo lépe roztokem síranu měďnatoamonného, který pohlcuje žluté paprsky a propouští paprsky bílé.

6 Antony van Leeuwenhoek
( ) Jednoduchý mikroskop (1660, 1674) Konvexní skleněná čočka byla připevněna do kovového držáku a byla zaostřována pomocí šroubu. čočka zaostřovací šroub držák vzorku V 60. letech 17. století holandský obchodník s plátnem z Deft v Holandsku, Antony van Leeuwenhoek, zhotovil a používal jednoduchý mikroskop. Vybrousil malou skleněnou kouli jako čočku se zvětšením až 270x a použil ji pro práci s prvním jednoduchým mikroskopem. Mikroskop vůbec neznal a musel jej sám objevit. Jako mladík prý jednou našem mezi haraburdím svého otce (vetešníka) skleněný střípek. Než jej vyhodil, položil ho náhodou na kousek látky. Kdyby šlo o dokonale rovný střep, nic moc by se nestalo. Kvůli nedokonalé výrobě byla však skla vždy více či méně zvlněná. Leeuwenhoek si všiml, že struktura tkaniva vypadá pod střepem docela jinak než při pozorování pouhým okem. Samozřejmě studoval kvalitu zboží, ale třeba také plísně na mase, vlastní krev nebo sperma. Jako první člověk na světě objevil existenci mikroorganismů. Své objevy začal popisovat a posílat Královské společnosti v Londýně. Učenci mu ale nevěřili. Když jim ale jejich kolega Robert Hooke přinesl svůj mikroskop a oni uviděli totéž, co popisoval Leeuwenhoek, uvěřili mu. Z pláteníka se stal zahraniční člen Královské společnosti a světoznámá osobnost. Zarputile však odmítal opustit rodnou hroudu a už vůbec nehodlal některý ze svých mikroskopů dát z ruky. A tak se podívat do "zázračných" přístrojů přišli k němu domů i ruský car a anglická královna. Když Leeuwenhoek roku 1723 v 91 letech zemřel, zbylo po něm 419 mikroskopů, z nichž některé zvětšovaly až 270krát. Leeuwenhoekovy přístroje byly nesmírně jednoduché, přesto ve své době neměly konkurenci. Dnešní mikroskopy nepřipomínaly ani v nejmenším. Jejich optickou část tvořila jediná čočka zasazená do mosazné destičky, vzorek se umisťoval na hrot před čočku a jeho pozice se dala nastavit dvojicí šroubů. Mikroskop se držel v ruce těsně u oka. Zatímco složitější přístroje ostatních konstruktérů dosahovaly s bídou padesátinásobného zvětšení, Leeuwenhoekovy mikroskopy zvětšovaly až 270x a jejich rozlišení bylo až 1,35 mm (tisícin milimetru). Právě to jejich tvůrci umožnilo spatřit do té doby neviděné. Zkoumal snad vše, co bylo možno umístit pod mikroskop - hmyz, krev, zubní povlak, jezerní vodu... Pozoroval bakterie, prvoky, spermie, krvinky, mikroskopické hlísty, vířníky. Tok krve v kapilárách úhoře dokonce roku 1698 osobně demonstroval ruskému carovi Petru Velikému.

7 Mikroskopy 17. století Jednoduchý tyčovitý mikroskop, stal se základním tvarem použitým u ostatních jednoduchých mikroskopů po několik století. 2. mikroskop ze slonoviny, stříbro, Itálie 3. Jednoduchý Italský mikroskop ze dřeva lignum vitae, objekty byly připevněny na dřevěném disku nad kterým byla čočka 4. Tento elegantní mikroskop měl dva ryté destičky, které jsou výklopné na jedné straně a připojené na rukojeť ze slonoviny. Je vyryto "Depovilly a Paris", byl vyroben kolem roku r 1686. 5. Tripodický mikroskop ze dřeva - lignum vitae (Guaiacum), lepenky a kůže vykládané zlatem 6. horizontální mikroskop – optická osa vodorovná, osvětlení Bonanni navrhl důmyslné ozubené kolečko pro jemné zaostření, velmi pokročilé pro toto časové období. Bonanni z mikroskopu měl také mnoho dalších pokročilých funkcí, jako kondenzor z dvojité čočky před osvětlením. lignum vitae, je jeden ze společných názvů pro dřeva stromů z rodů Guaiacum, Bulnesia aj., rostoucích kromě Jižní Ameriky také v Indii. Jde o jedny z nejtvrdších, nejhustších a nejtěžších dřev na světě - jejich objemová hmotnost ve vysušeném stavu se pohybuje většinou mezi 1100 až 1300 kg/m3. Některá dřeva (např. Guaiacum sanctum a G. sermientos) jsou zelenavě hnědá se žlutohnědým žilkováním a nepravidelnou kresbou, jiná (G. guatemalense) černohnědá se žlutým žíháním, další (G. officinale) až zelenočená. Vesměs jsou extrémně tvrdá a těžká, využívaná nejčastěji v lodním stavitelství a k výrobě strojních součástí.

8 Mikroskopy 18. století 1730 kolem r.1700 1761 Kostěný bezejmenný „bleší“ mikroskop - stále přetrvávají jednoduché mikroskopy(kolem 1700) Culpeperův mikroskop (Anglie)- složený, trojnožky z mosazi, dvě zrcátka, dřevo, chráněn měkkou kůží (1730) Na požádání krále Jiřího III zhotovil Georg Adams stříbrný mikroskop s ornamenty

9 Mikroskopy 19. století

10 Mikroskopy 20.století

11 Světelný mikroskop - základní pracovní nástroj
Cíl mikroskopie: zvětšit obraz rozlišit detaily v obraze Jednoduchý mikroskop jedna čočka nebo jeden systém čoček (lupa) Složený mikroskop více čoček nebo více systémů čoček

12 Lupa Mikroskop Skládá se z jedné čočky nebo z jediného systému čoček
Složitý přístroj, který umožňuje velké zvětšení mikroskopických objektů a má odstraněné vady čoček (vyklenutí zorného pole, astigmatická vada,…) Olympus CX31 Složení mikroskopu 1. Část mechanická: stativ, noha stativu, tubus, revolverový měnič objektivů, stolek, makrošroub, mikrošroub 2. Část osvětlovací: zdroj světla, zrcátko, polní clona, kondenzor, irisová clona, objímka filtru 3. Část optická: objektivy, okuláry

13 1. Část mechanická Stativ Noha stativu
Tubus - spojuje okulár a objektiv Mechanická (optická) délka tubusu - vzdálenost mezi horním a dolním koncem tubusu, mění se vzájemným posunem dvou na sebe nasunutých částí, dána výrobcem ( mm) a je nutno ji dodržovat - objektivy a okuláry konstrukčně přizpůsobeny - nekonečná délka tubusu (vkládání modulů),  - monokulární přímý, šikmý, binokulární, trinokulární Revolverový měnič objektivů Stolek - pohyblivý; s křížovým vodičem preparátu, který se ovládá dvěma šrouby Makrošroub - pro hrubé ostření Mikrošroub - pro jemné doostřování Úkolem objektivu je vytvořit zvětšený, skutečný a převrácený obraz předmětu (který se klade za jeho předmětové ohnisko) ve vzdálenosti D od obrazového ohniska. Úkolem okuláru je pak umožnit pozorování tohoto obrazu neakomodovaným okem. Předmětové ohnisko okuláru musí být tedy vzdáleno od od obrazového ohniska objektivu o D . Nastavení této vzájemné polohy objektivu a okuláru zajišťuje tubus. Veličina D se nazývá optickou délkou /intervalem) mikroskopu.

14 2. Část osvětlovací Pozorování ve světle procházejícím x dopadajícím
Zdroj světla - lampa v noze stativu s kolektorovou čočkou (fixně seřízená), kolektor spolu se zrcátkem soustřeďuje světlo do kondenzoru Polní clona - používá se při malém zvětšení, viz práce s mikroskopem Irisová clona (aperturní) - reguluje množství světla přicházejícího do mikroskopu, stupnice, podle které se nastavuje numerická apertura kondenzoru Kondenzor spojky, objímka; soustřeďuje paprsky pro dokonalé osvětlení zorného pole,optická osa osvětlovací soustavy musí procházet středem kondenzoru Numerická apertura kondenzoru má být vždy menší než numerická apertura objektivu (70-80%) Filtry - modrý, šedý

15 3. Část optická - čočky ČOČKY
Průhledné těleso omezené vypuklými (konvexními) a vydutými (konkávními) plochami Z funkčního hlediska rozlišujeme: spojky a rozptylky

16 3. Část optická - čočky Hlavní vady čoček:
Vada barevná (chromatická) Vada kulová (sférická) Vyklenutí zorného pole K odstranění uvedených vad se používají čočkové multiplety (dublety, triplety, …), tj. několik čoček spojených dohromady. Tyto čočky jsou vytvořené ze speciálních materiálů a mají určité poloměry křivosti optických ploch, čímž vznikají takové zobrazovací vady, které se v multipletu vzájemně vykompenzují. Je dobré si uvědomit, že danou optickou mohutnost čočky lze dosáhnout různou volbou poloměrů křivosti optických ploch.

17 Barevná vada neboli chromatická aberace
je vada, která souvisí s tím, že ohnisková vzdálenost čočky závisí na indexu lomu a ten se mění podle barvy použitého světla (tedy podle vlnové délky). Bílé světlo je však složeno z různých vlnových délek a každá jeho složka (tzn. každá barva) se při průchodu čočkou láme trochu jinak. Při průchodu čočkou s barevnou vadou tedy dochází k rozkladu světla. V důsledku této vady je obrazem bodu bod určité barvy, který je obklopen mezikružími jiných barev. Chromatickou vadu lze alespoň částečně odstranit vhodnou kombinací spojných a rozptylných čoček, což se nazývá achromatizací optické soustavy. Achromatizovanou soustavu nazýváme achromát. Barevná vada spojné čočky

18 Kulová vada Sférická (též kulová nebo otvorová) vada vzniká tehdy, pokud na čočku dopadá široký svazek paprsků, přičemž paraxiální paprsky se za čočkou setkávají v jiném bodě než okrajové paprsky širokého svazku. Tato vada způsobuje, že obrazem bodu není bod, ale rozmazaná kruhová ploška. Tuto vadu lze také částečně kompenzovat kombinací čoček.

19                                   Zklenutí obrazu Zklenutí (sklenutí) zorného pole je vada, která spočívá ve skutečnosti, že body ležící v rovině kolmé k optické ose se nezobrazují v rovině kolmé k ose, ale na zakřivené ploše. V rovině kolmé k optické ose tak nelze získat obraz, který by byl v celém rozsahu stejně ostrý. Tato vada souvisí s astigmatismem a bývá u anastigmátů odstraněna současně s astigmatismem.

20 3. Část optická - objektiv
Barevné označení objektivů – 4x červená, 10x žlutá, 20x zelená, 40x světle modrá, 60x tmavě modrá, 100x černá

21 3. Část optická - objektiv
Vytváří zvětšený převrácený a skutečný obraz předmětu Čím je kratší ohnisková vzdálenost objektivu, tím je větší zvětšení. Zvětšení objektivu - je vyznačeno (10x, 20x, 30x); dá se vypočítat z ohniskové vzdálenosti podle vzorce Z = 250 / f mm je tzv. normální zraková délka Numerická apertura (A) - vyjadřuje vztah mezi otvorovým úhlem (úhel, který svírají dva nejkrajnější paprsky, které se ještě dostanou do otvoru objektivu) a lomivostí prostředí objektiv A = N * sin α/2 α - otvorový úhel α N - index lomu prostředí mezi objektivem a preparátem preparát

22 Pracovní vzdálenost: Vzdálenost mezi preparátem a nejnižším bodem objektivu
Rozlišovací schopnost: Schopnost rozlišit dva body, tzn. že vyjadřuje minimální vzdálenost dvou objektů tak, aby byly vnímány jako dva jednotlivé objekty Hloubka ostrosti: Hloubka obrazu, v níž bude zaostřený obraz rovnoměrně ostrý. Hloubka ostrosti se zvětšuje se zavíráním aperturní clony. S rostoucí numerickou aperturou objektivu hloubka ostrosti klesá Číslo pole: Číselná hodnota, která ovlivňuje velikost zorného pole Průměr zorného pole: Skutečný průměr pozorovaného pole v milimetrech Celkové zvětšení: Součin zvětšení objektivu a zvětšení okuláru

23 3. Část optická - objektiv
Typy objektivů Achromáty - jednoduché, složené ze 2 až 6 čoček; je u nich korigovaná chromatická vada, a to pro žlutou až zelenou oblast spektra Apochromáty - korekce barevné vady pro tři základní barvy spektra, vyšší numerická apertura a lepší rozlišení detailů Planachromáty - barevně korigovány jako achromáty a korigováno i vyklenutí zorného pole (mikrofotografie) Planapochromáty - zcela odstraněno vyklenutí zorného pole i chromatická vada, patří k nejlepším a nejdražším objektivům Fluoritové objektivy - z fluoritového skla (vynikající optické vlastnosti), dobře propouští UV záření, vhodné pro fluorescenci ale i pro pozorování ve světlém poli

24 3. Část optická - objektiv
Suché objektivy - mezi objektivem a krycím sklem je vzduch Imerzní objektivy - imerzní olej (mezi objektiv a krycí sklo, mezi přední čočku kondenzoru a podložní sklo) NA >1

25 Homogenní imerzní systém Význam použití imerze
Frontální čočka kondenzoru Imerzní olej objekt Krycí sklo Frontální čočka objektivu Uzavírací médium Imerzní média index lomu materiál Index lomu vzduch 1,0003 voda 1,333 glycerin 1,4695 Parafinový olej 1,480 Cedrový olej 1,515 Syntetický olej anisol 1,5178 bromonaftalen 1,6585 metylenjodid 1,740 Opakovaně se v textu mluví o imerzním médiu a nutnosti jeho použití u objektivů, případně kondenzorů, s numerickou aperturou větší než 1. Ale proč, co to znamená? víme, že numerická apertura závisí jednak na úhlu, pod kterým do optické soustavy může vstupovat světlo, jednak na indexu lomu prostředí, kterým světlo před vstupem do soustavy prochází (viz Obr. 26). Víme také, že prostředí se mohou svým indexem lomu lišit (zatímco vzduch má index lomu téměř roven 1, sklo má index lomu 1,5 až 1,72). Pokud je mezi preparátem a objektivem vzduch, budou se paprsky po přechodu ze skla do vzduchu lámat od kolmice (z prostředí opticky hustšího do opticky řidšího). Některé z nich se odkloní natolik, že optickou soustavu objektivu minou, jiné, které na optické rozhraní krycího skla a vzduchu dopadnou hodně šikmo

26 Objektivy pro práci bez krycího skla - NCG (no cover glass)-hematologie
Objektivy s korekcí na tloušťku krycího skla - korekční prstenec Objektivy s irisovou clonou - omezení světelného toku objektivem, vliv na hloubku ostrosti Odpružené objektivy - zamezení mechanickému doteku čočky Objektivy pro speciální pracovní postupy - např. fázový kontrast, DIC

27 3. Část optická - okulár Zvětšuje obraz vytvořený objektivem
Zvětšení okuláru je prázdné - nezobrazuje více detailů, než bylo zobrazeno objektivem Typy okulárů Huygensův okulár H - skládá se ze 2 čoček, v kombinaci se slabými objektivy (achromáty) Ortoskopické okuláry O - nezkreslují zorné pole, v kombinaci s objektivy achromatickými a planachromatickými Kompenzační okuláry K - kompenzují chromatickou vadu objektivů, jsou určeny pro práci s apochromáty Periplanatické okuláry P - kompenzují chromatické vady a částečně i vyklenutí zorného pole, v kombinaci s planachromatickými objektivy Průměr zorného pole (FN - field number) mm, širokoúhlé okuláry (UW) - až 25 mm Projektivy - okulár používaný při mikrofotografii Brill okuláry - umožňují pozorování a kompenzaci pro dioptrické oko, dioptrická korekce, manžety

28 užitečné zvětšení mikroskopu -
(minimální - numerická apertura objektivu x 500) maximální - numerická apertura objektivu x 1000 objektiv 100x, NA 1, = okulár 13x = okulár 6,5x prázdné zvětšení

29 Délková měření mikroskopických objektů
v horizontální rovině, kolmé na optickou osu, se provádí pomocí okulárového a objektivového mikrometru. Okulárový mikrometr Okulárový mikrometr je skleněná destička, opatřená měřící stupnicí. Mikrometrická stupnice se umisťuje do roviny polní clony okuláru, tj. do přední ohniskové roviny očnice okuláru, takže se nezobrazuje celým mikroskopem, ale jen okulárem.Neměří se jím tedy vlastní objekt, ale jeho obraz, respektive meziobraz, vytvořený v rovině clony. Aby se z velikosti obrazu, vyjádřené určitým počtem dílků okulárového mikrometru, odvodila skutečná velikost měřeného objektu, musí se dotyčný počet dílků mikrometru znásobit mikrometrickou hodnotou. Tato hodnota, závislá na zvětšení a mechanické tubusové délce, se získává vzájemným pozorováním stupnic okulárového a objektivového mikrometru.

30 Objektivový (předmětový) mikrometr
Objektivový mikrometr je destička formátu podložního skla, opatřená mikrometrickou stupnicí, kde 1 mm je rozdělený na 100 dílků, 1 dílek = 0,01 mm = 10 mikronů. Stupnice je chráněna krycím sklem. Objektivový mikrometr neslouží zpravidla k přímému měření objektu, ale převážně jen jako délkový standard pro cejchování stupnice okulárového mikrometru a k určení zvětšení mikroskopu, nebo k určení měřítka zobrazení objektu mikrofotografií nebo kresbou.

31 Při cejchování a měření se postupuje takto: 1
Při cejchování a měření se postupuje takto: 1. Objekt, který se má měřit, nahradíme objektivovým mikrometrem a používaný okulár okulárem měřícím u něhož otáčením objímky očnice se jasně dioptricky zaostří stupnice mikrometru. 2. Mikroskopem se co nejpřesněji zaostří obraz stupnice objektivového mikrometru. Posouváním objektivového mikrometru (křížovým posuvem nebo rukou) a natáčením okuláru se oba nastaví do postavení, při kterém se obrazy jejich stupnic překrývají. 3. Zjistí se, kolika dílkům objektivového mikrometru odpovídá určitý počet dílků mikrometru okulárového. Z tohoto poměru se vypočítá, jaké délce odpovídá 1 dílek stupnice okulárového mikrometru ve skutečnosti. praktický příklad: 7 dílků, tj. 70 µm objektivového mikrometru se rovná (kryje) s 12 dílky okulárového mikrometru. Pak 1 dílek okulárového mikrometru má délkovou hodnotu 70 : 12 = 5,8 µm. Toto číslo je tzv. mikrometrická hodnota pro použitý objektiv a příslušnou mechanickou tubusovou délku mikroskopu.

32

33 Postup práce s mikroskopem
Mikroskop přenášíme oběma rukama (kapotáž) Manipulujeme pouze pomocí vroubkovaných částí 1. Zapneme mikroskop, nastavíme osvětlení, vložíme preparát, zařadíme objektiv 10x, zaostříme na preparát 2. Nastavíme vzdálenost okulárů a provedeme dioptrickou korekci (okulár bez dioptru zaostříme na objekt mikrošroubem, zavřeme oko; okulár s dioptrem doostříme podle svého oka). Použití manžet: při pozorování s brýlemi ponechte manžety ohrnuté, nikdy manžety neodstraňovat z hygienických důvodů !!!!!!!! 3. Nastavíme aperturní clonu 4. Zařadíme požadovaný objektiv a doostříme mikrošroubem. 5. Zařadíme filtr, přizpůsobíme osvětlení a pozorujeme

34 Úplné Köhlerovo osvětlení
skládá se ze zdroje světla kolektorové čočky irisové clony nastavujeme do optimální polohy clonu osvětlovacího systému clonu kondenzoru polohu kondenzoru 1. Umístíme preparát a zaostříme s objektivem 10x 2. Uzavřeme polní clonu 3. Kondenzor snižujeme nebo zvyšujeme tak dlouho, až je obraz svítícího pole ostře ohraničený 4. Polní clonu otevřeme tak, aby se dotýkala okrajů zorného pole. 5. Obraz svítícího pole posuneme centrovacími šrouby kondenzoru do středu zorného pole

35 Potřeby pro mikroskopování
Krycí skla -různá tloušťka (0,08; 0,11; 0,13;0,17;0,20 mm) - velikost (mm) a tvar Podložní skla - různá tloušťka (1; 1,2 mm) velikost (26 x 70 mm) - zabroušené hrany, matované Preparační soustavy - pinzeta, skalpel, nůžky, preparační jehly, štětec, pipeta Laboratorní sklo - Petriho miska, hodinové sklo, kádinka atd. Krabice na preparáty Slohy na preparáty

36 kvalita zobrazení biologických objektů závisí na
Kontrastní metody kvalita zobrazení biologických objektů závisí na 1. dostatečném zvětšení obrazu (maximální užitečné zvětšení = numerická apertura objektivu x 1000) 2. rozlišovací schopnosti mikroskopu (numerická apertura objektivu a kondenzoru, kvalita osvětlení preparátu - Koehlerovo osvětlení) 3. kontrastu obrazu (cytologická a histologická barviva, optické metody) 2. Rozlišovací schopnost mikroskopu závisí na numerické apertuře objektivu a kondenzoru a na kvalitě osvětlení preparátu t.j. na optimálním nastavení Koehlerova osvětlení. 3. Kontrast při zobrazování buněk lze velmi efektivně zvýšit pomocí cytologických a histologických barviv Kontrast buněk lze však rovně zvyšovat optickými metodami, které převádějí rozdíly v indexu lomurůzně tlustých částí objektů na jasový kontrast obrazu. Na tomto principu jsou založeny metody jako je např. fázový kontrast, Nomarského diferenciální interferenční kontrast a Hoffmanův modulační kontrast.

37 Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)
Fázový kontrast Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) Hoffmanův modulační kontrast (HMC) Dodtův infračervený gradientový kontrast (DGC) Fluorescence Konfokální laserová skanovací mikroskopie Vznik tohoto modulační kontrastu se datuje do r Jde v podstatě pouze o velmi dokonalou verzí šikmého osvětlení, které se používá ke zvýraznění kontrastu neabsorbujících předmětů. Vznik kontrastu při HMC. je důsledek asymetrické filtrace Fourierova obrazu, což je typické pro všechny metody využívající mimoosové (anaxiální) osvětlení. Virtuálním zdrojem světla zajišťujícím šikmé osvětlení je obdélníková štěrbina nacházející se v přední ohniskové rovině kondenzoru. V místě jejího obrazu v zadní ohniskové rovině objektivu je umístěn modulátor. Modulátorem je maska, jejíž tvar se kryje s obrazem štěrbiny kondenzoru. Štěrbina modulárotu z jedné strany sousedí s absorbující plochou (nepropustná zona, zabírá méně než 10% apertury objektivu), z druhé strany je neabsorbující plocha (propustná zona).. Záření zdroje se po průchodu vzorkem s gradientem optické tloušťky odchýlí od původního směru šíření, jednotlivé příspěvky k odchýlenému záření vytvoří v zadní ohniskové rovině objektivu dílčí obrazy kondenzorové clony, které jsou však posunuty vůči štěrbině modulátoru. Je=li gradient kolmý na osu štěrbiny, posune se její tvar v závislosti na znaménku tohoto gradientu buď do nepropustné nebo do čiré zony modulátoru. Takové posunutí je provázeno ztemněním, při opačném gradientu zjasněním, příslušného místa v mikroskopickém obrazu. Výhody: Výsledný obraz budí dojem šikmo osvětleného reliéfu a je velmi podobný zobrazení pomocí Nomarského DIC, cena potřebných doplňkových komponent mikroskopu je však při HMC podstatně nižší než při DIC. Hlavní předností HMC oproti DIC, kromě ceny, je možnost pozorovat objekty i na dvojlomných podložkách (např. buněčné kultury v plastikových miskách), které se pro DIC, kde je podstatná polarizace zobrazujícího světla, mohou stát zdrojem rušivých efektů. 1.11. Dodtův infračervený gradientový kontrast (Dodt gradient contrast DGC). Tento kontrast byl vyvinut teprve nedávno pro vizualizaci buněk ve tkáňových řezech v minulých deseti letech, jeho princip dosud nebyl zveřejněn.. Tubus je namontován mezi zdroj světla a mikroskop, kontrast je vhodný pro všechny typy objektivů, neinterferuje s fluorescenčním snímáním.

38 Metoda fázového kontrastu
Frits Zernike, 1934 Nobelova cena Karl Zeiss, Jena vlnová délka λ amplituda λ/4 amplituda - intenzita světla vlnová délka - barva fázový posun - neviditelný pro lidské oko ZAŘÍZENÍ PRO FÁZOVÝ KONTRAST změna fáze vlnění na změnu amplitudy = viditelné pro člověka Nebarvené objekty různá optická hustota změna fáze Fyzikální principy fázového kontrastu nejsou snadno přístupné. Naopak praktické používání fázového kontrastu ve světlené mikroskopii nečiní většinou žádné potíže. Stručně můžeme říci, že lidské oko je schopno vnímat rozdíly v amplitudě světelného vlnění jako rozdílnou intenzitu světla a rozdíly ve vlnové délce jako různou barvu světla. Nezbarvené (průhledné) objekty jsou pro světlo téměř všude stejně prostupné, ale protože jejich různé části mají různou optickou hustotu, lomí světlo každá z nich pod jiným úhlem. V důsledku toho se světelné paprsky vystupující z preparátu liší fází svého vlnění, amplituda zůstává nezměněna. Změna fáze světla, která nastává při průchodu objektem, není zrakem přímo viditelná. Nemá-li tedy objekt detaily, lišící se kontrastem, je pro lidský zrak průhledný, čirý. U řady biologických objektů tyto vlastnosti převažují a proto je zrakem obtížně identifikujeme. Mikroskop, vybavený pro pozorování ve fázovém kontrastu, nám umožňuje pozorovat i takové objekty, které způsobují jen fázový posun světla. Hlubší poznatky o tomto principu jsou součástí fyzikální optiky.

39 Kondenzor - aperturní kroužek pro různé zvětšení
Objektivy pro fázový kontrast - fázový prstenec (převádí neviditelné fázové rozdíly na rozdíly amplitudové) Kondenzor - aperturní kroužek pro různé zvětšení Centrovací dalekohled - seřízení fázových prstenců Zelený filtr- 540 nm objekt kondenzor objektiv fázová destička (difrakční ploška) Mikroskop pro pozorování ve fázovém kontrastu musí být pro tuto metodu vybaven. Potřebujeme objektivy pro fázový kontrast a kondenzor pro fázový kontrast. Oba tyto optické díly jsou opatřeny tak zvanými fázovými prstenci. U objektivů jsou jejich trvalou částí, u kondenzoru jsou používány podle potřeby. Objektivy pro fázový kontrast mají na jedné ze svých čoček nanesený neprůhledný "fázový" prstenec, na kterém nastává posun fáze světelné vlny. Objektivy pro fázový kontrast mohou sloužit též pro pozorování bez fázového kontrastu, avšak prstenec v objektivu způsobuje v tomto případě mírné snížení jakosti obrazu - udává se přibližně 10 %. U objektivu s malým zvětšením se toto zhoršení prakticky neprojevuje. Fázový kontrast je značně závislý na seřízení mikroskopu. K tomu se dodává účelná pomůcka, tzv. středící (centrovací) dalekohled. Ten se nasadí místo jednoho okuláru a pak pozorujeme polohu fázových prstenců, které můžeme vystředit pomocí nastavovacích prvků. Přesný postup je v návodu ke každému mikroskopu, nicméně vyžaduje trochu zkušeností. Je běžné používat pro světlé pole a fázový kontrast společné objektivy až do zvětšení 40x, pro vyšší zvětšení je téměř nutné používat pro každou metodu jednoúčelový objektiv. Kondenzor pro fázový kontrast bývá u jednoduchých mikroskopů vybaven tzv. šoupátkem, nesoucím 1 nebo 2 fázové prstence. Tyto fázové prstence jsou svým tvarem přizpůsobeny vždy objektivu s určitým zvětšením. Dokonalejší mikroskopy jsou vybaveny univerzálním otočným kondenzorem, vybaveným třemi fázovými prstenci, prstencem pro pozorování v tmavém poli a otvorem pro pozorování ve světlém poli. Volba se provádí otáčením karuselu, nesoucím jednotlivé prstence. Pozorování při fázovém kontrastu se podstatně zlepší, použijeme-li zelený interferenční filtr. Tento filtr propouští zelené světlo vlnové délky kolem 540nm, které zvyšuje vjem kontrastů. Oko je na tuto vlnovou délku světla maximálně citlivé. Fázový kontrast (Řeřábek Jaroslav, 1953: technika výzkumu živočišné buňky Normální mikroskop nedovoluje rozlišovat s dostatečnou výrazností drobné buněčné organely, musíme proto preparáty barvit; Fázovým kontrastem rozlišíme i v živých buňkách chromozomy, chondriom nebo jádro, aniž bychom objekt poškodili, cenné pro experomenty s kulturami in vitro. Princip FC záleží v přeměně fázových rozdílů světla , které prošlo objektem, na rozdíly amplitudy zjistitelné okem. Kondenzor je opatřen výměnnými štěrbinovými aperturami, každá kruhová apertura má určitý poloměr a šířku. Objektiv s difrakční (ohýbá světlo) ploškou, jejíž tvar je shodný s obrazem kruhovité apertury kondenzoru, který se sem promítá. Světlo, které prošlo štěrbinou kondenzoru a neprošlo žádnou z fází objektu, doznává na difrakční plošce objektivu zvětšení amplitudy o čtvrtinu (jsou jasnější), kdežto paprsky, které prošly fázemi objektu ( vrstvou o větší hustotě), mají amplitudu změněnou různě menší měrou. Tento úkaz se v zorném poli jeví jako různě velké zvýšení rozdílů světlosti nebo temného tónu drobných buněčných částí a zvyšuje jejich kontrastnost tak, že je dobře rozeznáme. Je třeba provést adjustaci = fázová clona kondenzoru se nastaví proti odpovídajícími objektivu s fázovou destičkou, do okulárového konce tubusu vsuneme pomocný okulár, který nastavovacím šroubem na jeho plášti zaostříme tak, abychom viděli obraz obou kruhů kondenzoru a objektivu. Potom pohybujeme posuvnými šrouby na kondenzoru tak dlouho, až v zorném poli se obrazy obou kruhových útvarů přesně kryjí. Pomocný okulár nahradíme normálním okulárem a pracujeme. Kontrast v optické mikroskopii Jaromír Plášek, Josef Reischig  Publikováno: Vesmír 74, 638, 1995/11  Kvalitu zobrazení mikroskopických objektů charakterizují tyto parametry: zvětšení, rozlišovací schopnost mikroskopu a obrazový kontrast. Zvětšení mikroskopu je dáno součinem zvětšení objektivu a okuláru. Tento parametr je v podstatě nejméně důležitý, byť laiky zpravidla nejvíce přitahuje. Maximální zvětšení dosažitelné nejlepšími objektivy, které by bylo užitečné při vizuálním pozorování, je 500x až 1000x. Zvětšíme-li pomocí silnějšího okuláru obraz nad tuto mez, získáme jen prázdné zvětšení – to jest větší obraz bez jakýchkoli nových detailů. Rozlišovací schopnost mikroskopu je shodná s rozlišovací schopností jeho objektivu. Úzce souvisí s tím, že ke vzniku obrazu přispívají difrakční jevy. Ideální bod se proto nezobrazí opět jako bod, nýbrž jako poněkud rozmazaná malá ploška. Při vizuálním pozorování a s nejkvalitnějšími objektivy je rozlišovací schopnost optických mikroskopů mírně lepší než polovina vlnové délky použitého světla. Samotná vynikající rozlišovací schopnost objektivu však ještě nezaručuje, že teoreticky rozlišitelné strukturní detaily v mikroskopickém obrazu skutečně uvidíme. Můžeme je spatřit jen tehdy, existuje-li dostatečný rozdíl jasu mezi nimi a jejich okolím. Kontrast zobrazení je charakterizován poměrem rozdílu mezi jasem objektu a jasem pozadí k jasu tohoto pozadí. Pro strukturní elementy uvnitř objektů bude definice kontrastu samozřejmě mít trochu jinou podobu, což však pro nás není nijak významné. Primárním zdrojem kontrastu je interakce mikroskopických objektů s osvětlujícím zářením. Uplatnit se může: difrakce absorpce rozptyl světla ohyb světla lom světla dvojlom polarizovaného světla fluorescence Nakolik se libovolný z vyjmenovaných jevů bude skutečně podílet na vzniku a kvalitě obrazu, to závisí na konstrukci mikroskopu. Na rozdíl od makroskopických objektů, které vidíme pouhým okem, nemívají proto obrazy mikroskopických objektů jedinou možnou podobu. Konkrétní vzhled mikroskopických objektů závisí zásadním způsobem na použité mikroskopické technice. Nebudeme se zabývat technikami kombinovanými s digitalizací a počítačovým zpracováním obrazů, jako jsou např. videomikroskopie, konfokální mikroskopie (viz Vesmír 74, 508, 1995/9) a rastrovací optická mikroskopie bez čoček. Zobrazení ve světlém poli a pozorování absorbujících objektů Pozorování ve světlém poli je základní mikroskopickou technikou. Světlo z kondenzoru prochází vzorkem a vstupuje do objektivu. Objekty vidíme díky tomu, že jsou schopny absorpcí zeslabovat intenzitu procházejícího záření. Tato metoda je proto vhodná jen pro objekty buď zcela nepropustné, nebo alespoň barevné. Příkladem barevných objektů jsou třeba chloroplasty nebo chitinový exoskelet hmyzu. Viditelnost většiny biologických preparátů je zpravidla třeba zlepšit barvením. Cytochemické a histochemické postupy umožňují specificky barvit nejrůznější biologické tkáně. Je ovšem třeba zdůraznit, že barvením se vedle základní informace o fyzické morfologii strukturních detailů zkoumaných objektů získává též informace o jejich chemickém složení. Fluorescenční mikroskopie Zvláštní skupinu mikroskopických barviv představují barviva fluorescenční, která při ozařování světlem vhodné vlnové délky reemitují část absorbovaného záření jako fluorescenci. Emise je spektrálně posunuta oproti excitačnímu záření směrem k větším vlnovým délkám. Existující fluorescenční barviva umožňují specifickou detekci buněčných organel, monitorování koncentrací intracelulárních iontů nebo po navázání na protilátky slouží k identifikaci receptorů na buněčných površích apod. Řada biologických objektů však obsahuje svá přirozená fluorescenční barviva (např. chlorofyl nebo karotenoidy). Fluorescenční mikroskop se od obyčejného mikroskopu liší párem spektrálních filtrů. První z nich je součástí osvětlovací soustavy a slouží k vymezení vlnové délky budicího záření. Druhý je za objektivem a propouští jen emisi, budicí záření musí zadržet. Pozorování neabsorbujících objektů Aby bylo možné neabsorbující objekty pozorovat, musí se od svého okolí lišit alespoň indexem lomu, který spolu s jejich tloušťkou ovlivňuje fázi procházejícího světelného vlnění. Posun fáze není ovšem jediným optickým jevem, s nímž se u fázových objektů setkáváme. Na rozhraní mezi objektem a okolním prostředím dochází k odrazu a lomu světla. Malé strukturní detaily světlo rozptylují. Za určitých podmínek se může stát, že část zobrazujícího světla je takto vržena mimo objektiv a nemůže tudíž přispět ke zvýšení celkového jasu obrazu. Proto se např. stěny stélek, okraje buněk i kontury jiných nebarevných objektů při zobrazení ve světlém poli jeví tmavší než pozadí. Metody pozorování fázových objektů lze trochu netradičně rozdělit do dvou kategorií. Do první spadají metody využívající různých forem šikmého osvětlení. Ty slouží především ke zvýraznění těch objektů a strukturních detailů, které výrazně mění směr šíření jimi procházejícího světelného záření. Patří sem pozorování v temném poli a Hoffmanův modulační kontrast. Do druhé skupiny náleží metody umožňující přímou detekci fázových posunů procházejícího světelného záření: fázový kontrast, interferenční mikroskopie, Nomarského diferenciální interferenční kontrast a polarizační mikroskopie. Šikmé osvětlení Šikmé osvětlení používal ke zviditelnění neabsorbujících objektů již Ernst Abbe koncem minulého století. Kondenzor mikroskopu musí být asymetricky zacloněn nebo excentricky nastaven, aby část světelného kužele, který z kondenzoru vystupuje, procházela mimo objektiv. To vede ke snížení jasu zorného pole mikroskopu. Objekty či jejich strukturní detaily, které ohybem, odrazem či rozptylem světla mění směr chodu paprsků tvořících tento kužel, se pak ve výsledném obraze jeví jako tmavší nebo světlejší než pozadí podle toho, zda část paprsků světelného kužele odchýlily ještě více mimo objektiv, nebo je naopak do objektivu nasměrovaly. Charakteristickým znakem obrazů získaných při šikmém osvětlení je jejich výrazná asymetrie. Vypadají jako šikmo nasvícené trojrozměrné objekty, na jedné straně světlé, na protější ponořené ve stínu. Popsaný vizuální efekt však zpravidla nemá mnoho společného s jejich reálnou prostorovou strukturou. Při pozorování v temném poli je konstrukcí osvětlovací soustavy zajištěno, že do objektivu se dostane jen světlo, které interakcí se vzorkem pozměnilo směr šíření. Zorné pole je proto zcela tmavé a pozorované objekty září na temném pozadí. V temném poli lze snadno detegovat velmi malé objekty, včetně takových, jejichž rozměry jsou pod hranicí teoretické rozlišovací schopnosti mikroskopu. Pro seriózní studium valné většiny objektů se však pozorování v temném poli nehodí, neboť je při něm nadměrně zdůrazněn kontrast kontur a malých strukturních detailů. Atraktivní variací temného pole je Rheinbergovo optické barvení, při němž je kondenzorová apertura a maska z transparentních optických filtrů, nejčastěji ve dvou různých základních barvách. Tak dosáhneme toho, aby se pozorované objekty objevily třeba v červené barvě na zeleném pozadí. Hoffmanův modulační kontrast je v podstatě zdokonalenou verzí šlírové mikroskopie, při které je šikmého osvětlení dosaženo pomocí mimoosově umístěné štěrbinové apertury v přední ohniskové rovině kondenzoru. Kondenzor spolu s objektivem zobrazuje tuto štěrbinu do zadní ohniskové roviny objektivu, kde se v místě jejího obrazu nachází maska, která blokuje volný průchod osvětlujícího záření objektivem. Při prosté šlírové mikroskopii je tato maska z nepropustného materiálu a výsledek se podobá pozorování v temném poli. Při Hoffmanově modulačním kontrastu se objektivová maska skládá ze tří zón o různé propustnosti a výsledek je podobný zobrazení při obyčejném šikmém osvětlení s excentrickým kondenzorem. Přímá detekce fázových posuvů Fázový kontrast (F. Zernikovi byla za tento vynález r udělena Nobelova cena) převádí fázové posuvy světelného vlnění, které prošlo vzorkem, na změny intenzity v obraze. Pomocí kondenzorové apertury měníme cíleným způsobem relativní fázový posuv mezi nedifraktovaným osvětlujícím zářením a částí světla, které při průchodu vzorkem změnilo nejen fázi, nýbrž i svůj směr šíření. Interference difraktovaných a nedifraktovaných složek pak vyjeví, jaký je relativní posuv fáze světla procházejícího vzorkem oproti světlu, které procházelo pozadím. Při fázovém kontrastu se často používá kvazimonochromatického osvětlení žlutozelené barvy (na takové světlo je lidské oko nejcitlivější) a fázová maska zpožďující fázi difraktovaného záření o čtvrtinu vlnové délky. Fázové objekty pak vidíme jako tmavé na světlém pozadí, tím tmavší, čím je objekt silnější (pozitivní fázový kontrast). Fázovou masku je ale možno zhotovit i tak, že zpožďuje nedifraktované záření. Pozorované fázové objekty se pak jeví jako světlé na tmavším pozadí (negativní fázový kontrast). Pokud osvětlíme vzorek bílým světlem, bude jeho obraz zbarvený, neboť fázové poměry mezi interferujícím difraktovaným a nedifraktovaným zářením závisí ze zřejmých důvodů na vlnové délce. Závažným nedostatkem fázového kontrastu je existence halo, což je jasně zářící rozhraní mezi objektem a okolním prostředím, které vzniká v důsledku lomu světla na stěnách mikroskopických objektů, zejména když jsou z materiálu o vysokém indexu lomu. Pokud se chceme vyhnout tomuto nepříjemnému efektu, musíme použít Hoffmanův modulační kontrast nebo Nomarského techniku. Interferenční mikroskopie, Nomarského diferenciální interferenční kontrast. Při fázovém kontrastu necháváme interferovat difraktované záření s tím, které při průchodu vzorkem nezměnilo směr šíření, když jsme napřed důmyslným způsobem pozměnili jejich relativní fáze. Při klasické interferenční mikroskopii detegujeme fázové posuvy zobrazujícího záření pomocí jeho interference s referenčním paprskem, pro který je v interferenčním mikroskopu zvláštní dráha, oddělená od té, po které prochází světlo interagující se vzorkem. Interferenční mikroskopie se používá hlavně k absolutnímu měření hodnot fázových posuvů. Diferenciální interferenční kontrast dle Nomarského umožňuje díky páru vložených Wollastonových hranolů a páru zkřížených polarizátorů interferenci světelných příspěvků, které přicházejí ze sousedních míst vzorku, vzdálených od sebe o méně, než činí rozlišovací schopnost mikroskopu. Takto se zviditelní oblasti, kde existují gradienty optické dráhy zobrazujících paprsků (optická dráha je součinem geometrické tloušťky a indexu lomu objektu). Zobrazení fázových objektů Nomarského metodou se velice podobá tomu, co můžeme vidět pomocí obyčejného šikmého osvětlení nebo pomocí Hoffmanova modulačního kontrastu. Stejné gradienty optické dráhy se však zpravidla vyjeví s podstatně lepším kontrastem. Díky užití zkřížených polarizátorů se Nomarského mikroskop současně chová i jako obyčejný polarizační mikroskop, v němž anizotropní objekty s dvojlomem jasně září na temném pozadí. Tato skutečnost někdy příznivě přispívá ke zlepšení obrazového kontrastu. Mnohdy však je to jev spíše rušivý, jako např. při pozorování tkáňových struktur na kultivačních miskách z lisovaných organických skel, což jsou materiály silně dvojlomné. V takových případech je vhodnější použít Hoffmanovu techniku. Polarizační mikroskopie umožňuje zviditelnit struktury, jejichž stavební materiál se vyznačuje dvojlomem. Polarizační mikroskop se od běžného mikroskopu liší vloženým párem zkřížených polarizátorů a kompenzační destičkou. Dvojlomné objekty i jejich pozadí zobrazuje v pestrých barvách, přičemž konečný výsledek závisí jak na tloušťce a optických vlastnostech objektů, tak i na nastavení kompenzační destičky. Největší uplatnění nalezl polarizační mikroskop v krystalografii. ¨ Obrázky    tisk článku      vložit komentář  [0] fázová clona (štěrbinová apertura)

40 Seřízení fázových destiček

41 apodizovaný fázový kontrast
Problém halace apodizovaný fázový kontrast křídlo motýla Malformovaný střední háček diplozoona procházející světlo x fázový kontrast .8. Fázový kontrast R holandský fyzik Frederik Zernike uveřejnil princip fázového kontrastu v mikroskopu. Při fázovém kontrastu je do přední ohniskové roviny kondenzoru vložena kondenzorová maska (apertura ve tvaru úzkého mezikruží), která je kondenzorem a za ním následujícím objektivem zobrazena do zadní ohniskové roviny objektivu. Zde se nachází skleněná podložka s nanesenou fázovou maskou (tenká transparentní vrstva o vhodném indexu lomu) ve tvaru mezikruží, které se překrývá s obrazem kondenzorové apertury. Fázová maska mění fázi procházejícího záření o úhel α, případně může procházející záření také částečně absorbovat. Kontrast obrazu fázového objektu vůči pozadí roste s klesající propustností fázové masky. Fázová destička bývá zhotovena tak, že mění fázi buď o úhel π /2 nebo -π /2. Při fázovém kontrastu se intenzita světla v obrazu objektu mění lineárně se změnou fáze světla procházejícího objektem. S fázovou maskou měnící fázi o -π /2 se silnější části objektu jeví tmavší, tzv. pozitivní fázový kontrast. Při změně fáze o π /2 je tomu naopak, tzv. negativní fázový kontrast. Při fázovém kontrastu se často používá kvazimonochromatického osvětlení (žlutozelené světlo), při použití bílého světla bude obraz vzorku zbarvený, neboť úhel a o který fázová maska mění fázi procházejícího světla, závisí na vlnové délce. Nejmenší rozdíly v tloušťce různých buněčných struktur, které můžeme pomocí fázového kontrastu zaznamenat se tedy blíží k hodnotě 0.1 µm. Nevýhody: Při pozorování silně lomivých objektů (např kvasinek) vzniká tzv. halo, což je jasně zářící rozhraní mezi objektem a okolním prostředím, v němž se ztrácejí skutečné hranice objektů. Druhým nedostatkem fázového kontrastu je to, že silně absorbující zbarvené objekty nemusí být ve fázovém kontrastu vůbec viditelné.

42 Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)
- povrchová topologie objektu kolem 1950, Georges Nomarski mikroskop Carl Zeiss polarizátor Wollastonův hranol kondenzor preparát objektiv analyzátor lineární polarizace světla rozdělení polarizovaného světla na dvě složky interference dvou laterálně posunutých obrazů a srovnání fázových rozdílů v celé ploše obrazu zvětšený obraz vzorku se jeví jako šikmo osvětlený trojrozměrný objekt vzniknou dva identické obrazy objektu, které jsou vůči sobě laterálně posunuty různá tloušťka preparátu = fázové rozdíly Německá firma Carl Zeiss vyvinula r.1959 interferenční mikroskop, který umožnil vytváření a vyhodnocování optických interferencí ve zvětšeném biologickém preparátu. Umožnil tak zvláště povrchovou topologii preparátu. Od běžného mikroskopu se liší vloženým párem Wollastonových dvojlomných hranolů a párem zkřížených polarizátorů světla. Světlo vstupující do kondenzoru je nejprve lineárně polarizováno polarizátorem P1. Pak prochází prvním hranolovým děličem, přičemž směr jeho polarizace svírá s optickými osami hranolového děliče úhel 45°. Druhý hranol shodně orientovaný s hranolem prvním, se nachází těsně za zadní ohniskovou rovinou objektivu. Následuje polarizátor P2, který je kvůli lepšímu kontrastu zobrazení zkřížen s P1. V důsledku rozdělení původně polarizovaného světla hranolem vzniknou dva identické obrazy předmětu, které jsou vůči sobě laterálně posunuty, vznikne zvětšený rozdvojený obraz. Wollastonovy hranoly pro DIC se vyznačují tím, že úhlový rozdíl vystupujících paprsků je velmi malý (asi radiánu), laterální posun dvou obrazů je za těchto podmínek pod hranicí rozlišovací schopnosti mikroskopu. V předmětové rovině je ekvivalentem tohoto posunu vzdálenost odpovídající 0.1 mm. Analyzátor P2 orientovaný pod úhlem 45o vůči vzájemně kolmým polarizacím dvou laterálně posunutých obrazů, vytváří podmínky pro jejich interferenci. Prvním (objektivovým) hranolem způsobené fázové rozdíly však nejsou stejné pro světlo pocházející z různých míst plošného světelného zdroje. Úkolem druhého hranolu (kompenzačního) je proto učinit fázový rozdíl konstantní v celé ploše objektivového hranolu. Hodnotu konstantního fázového rozdílu lze plynule měnit laterálním posouváním obou Wollastonových hranolů vůči sobě, čímž se výrazně ovlivňuje vzhled obrazu. Platí, že pokud určitý gradient optické dráhy vede ke zvýšení jasu obrazu, pak opačný gradient se projeví snížením jasu. Zvětšený obraz vzorku se proto jeví jako šikmo osvětlený trojrozměrný objekt.

43 Ancylostoma duodenale
Clonorchis sinensis červené krvinky řez ledvinou myši příchytné svorky diplozoona pylové zrno borovice

44 Nové technologie mikroskop s videokamerou
spojení počítače s mikroskopem digitalizace a analýza obrazu DIGITÁLNÍ MIKROSKOP Olympus MIC-D Místo klasického pozorování pomocí okulárů zobrazuje MIC-D na monitoru osobního počítače, který je s mikroskopem spojen USB kabelem. Protože se jedná o digitální obraz, jeho zpracování je velmi rychlé a snadné: uživatel jej může uložit, vymazat, upravit, vytisknout, umístit na web nebo poslat em.