Bioelektrické jevy a jejich měření 4. přednáška. Obecná elektrofyziologie buněk A) Elektrofyziologie organel Mitochondrie, endoplasmatické retikulum a.

Prezentace na téma: "Bioelektrické jevy a jejich měření 4. přednáška. Obecná elektrofyziologie buněk A) Elektrofyziologie organel Mitochondrie, endoplasmatické retikulum a."— Transkript prezentace:

1 Bioelektrické jevy a jejich měření 4. přednáška

2 Obecná elektrofyziologie buněk A) Elektrofyziologie organel Mitochondrie, endoplasmatické retikulum a vápníková signalizace. Struktura jaderných obalů a elektrofyziologie jaderných membrán: přímý přístup (patch clamp) a „technika přesýpacích hodin“ jako přístup nepřímý. C) Bioelektrické jevy v nervových a svalových buňkách Iontové kanály a jejich elektrické charakteristiky (vodivost, bod zvratu). Exocytosa na presynaptické membráně a její vztah ke kapacitě buňky. B) Membránové potenciály rostlinných buněk Odlišnost rostlinných akčních potenciálů (AP) od živočišných. Intracelulární měření: klasické intracelulární měření, příprava protoplastů. AP u citlivky a mucholapky, příklady elektrických odpovědí rostlin na různé stimuly. D) Studium vztahů pre- a postsynaptických dějů Vztah velikosti presynaptického stimulu a postsynaptické odpovědi. Role vápníku při výlevu neuropřenašeče.

3 A) Elektrofyziologie organel Mitochondrie (MT) a endoplasmatické retikulum (ER) – intracelulární snímání, patch clamp  přísná regulace hladiny cytoplasmatického vápníku v živých buňkách (neboť Ca 2+ je jedním z nejdůležitějších druhých poslů a jako takový ovlivňuje celou řadu dalších reakcí)  za fyziologických okolností udržuje živá buňka intracelulární koncentraci vápenatých iontů v rozmezí desítek až stovek nanomolů; extracelulární koncentrace vápenatých iontů je pak zhruba o čtyři řády vyšší.  Koncentrace cytoplasmatického vápníku není konstantní, v případě vzrušivých tkání kolísá zejména v závislosti na elektrické aktivitě tkáně (vtok do terminály, výlev ze sarkoplasmatického retikula). Periodicky tedy vyvstává potřeba vypufrovat náhle zvýšenou hladinu cytoplasmatického vápníku na fyziologickou hodnotu, ev. následně přebytky Ca 2+ uvnitř buňky odstranit do hlavního rezervoáru vápníku – extracelulárního prostoru (Ca 2+ pumpy, Na + /Ca 2+ pumpy).  nebo sekvestrace Ca 2+ do intracelulárních rezervoárů: hlavními „skladovacími prostorami“ nadbytečného a nežádoucího cytoplasmatického vápníku jsou mitochondrie, dále pak cisterny endoplasmatického/sarkoplasmatického retikula a cisterny Golgiho aparátu  v nervových zakončeních jsou zřejmě dominantní vápník pufrující organelou mitochondrie, v somatech pufrační úlohu hrají spíše cisterny retikula, neboť vzestup koncentrace cytoplasmatického Ca je v oblastech buňky s velkým poměrem povrchu a objemu (jako je terminála) podstatně větší a lépe je regulován rychlým pasivním transportem Ca 2+ přes membránu mitochondrií než pomalým aktivním transportem vyžadujícím účast vápníkových pump na membráně endoplasmatického retikula.

4 Změny v koncentraci Ca 2+ v ER acinárních buněk pankreatu (patch clamp, whole cell). Pipeta byla naplněna roztkem s BAPTA/Ca pufrem. Vidíte [Ca 2+ ] změny navozené aplikací ACh, vychytání vápníku ER a následné uvolňování Ca 2+ z ER pasivním výtokem. (Camello et al., Cell Calcium (2002) 32(5–6), 355–361).  pulsace Ca 2+ kontrolují energetický metabolismus mitochondrií a tím celé buňky (přílišná koncentrace Ca 2+ v matrix vede k poruchám oxidativní fosforylace, v horším i k osmotickému nasávání vody, otoku až prasknutí mitochondrií) Fyziologický význam mitochondriální/ER Ca 2+ signalizace:  hromadění Ca 2+ v lumen ER či MT může být velmi nebezpečné, neboť může dojít k nechtěnému uvolnění těchto zásob; ER a MT spolu musí intenzivně komunikovat  uvolnění značného množství Ca 2+ do cytosolu aktivuje mnohé signální kaskády aj., v nejhorším až spouští apoptózu: další šíření vln Ca 2+ (přes IP 3 Rs) spustí mitochondriální fázi apoptotické reakce

5 studium Ca 2+ -indukovaného Ca 2+ výlevu (CIRC) při výlevu váčků na synapsi – způsob, jak zvýšit účinnost a plasticitu synapse studium Ca 2+ výlevu z organel při ischemickém poškození buňky/tkáně (MT nerespiruje a netranslokuje protony, je bez energie; indukce přechodného kanálu označovaného zkratkou PTP (permeability transition pore) o šířce 2-3 nm a vodivosti pro Ca 2+ okolo 1,3 nS) – typická příčina nektorické nebo apoptotické smrti buňku při hypoxickém, ischemickém nebo traumatickém poškození mozku: vývoj neuroprotektiv zasahujících specifické enzymy (např. kaspasy), anti-death genových produltů (Bcl-2, Bcl-X 1 ) otravy a role buněčné smrti navozené masivním výlevem Ca 2+ do cytosolu (působení chelatačních agens, také těžké kovy, zvýšená hladina anorganického fosfátu v mitochondriální matrix, thioly a organické hydroperoxidy ) Fyziologický/patofyziologický význam mitochondriální/ER Ca 2+ signalizace: Po předchozí stimulaci vzrostla amplituda excitačních ploténkových potenciálů (EPPs) více než 15x. Při stimulaci vtékal Ca 2+ do terminály, by vychytán ER a MT a následně uvolňován z MT a ER pasivním výtokem. To při další stimulaci zvýšilo amplitudu a kvantový obsah EPPs, neboť výlev je děj Ca 2+ -dependentní. (Narita et al., J Gen Physiol (2000) 15), 519–532).

6 Ca 2+ Ca 2+ pumpa Bcl-2 IP 3 R RyR ribosomální translokační komplex ATP–navozený výtok ATP ADP + P i cytosol ER (SR) „přirozené“ ionofory cyklus TCA Zjednodušené schéma mitochondrie s hlavními složkami řetězce transportu elektronů a předpokládanými dráhami vtoku a výtoku vápenatých iontů. I-IV, respirační komplexy řetězce transportu elektronů; cyt c, cytochrom c; PTP, přechodný vápníkový kanál vnitřní mitochondriální membrány (permeability transition pore); F 0 F 1 -ATPasa. Růžově transportní systémy vápníku, modře transportní systémy protonů a elektronů. Podle Jacobson a Duchen, 2004. Možné cesty výtoku vápníku z ER/SR. (Camello et al., Cell Calcium (2002) 32(5–6), 355–361).

7 Jaderné membrány – patch clamp jaderného obalu, nuclear hourglass technika Trocha morfologie: jaderná obálka se skládá z vnější a z vnitřní jaderné membrány a z prostoru membránové cisterny nazývané také perinukleární prostor. Obě jaderné membrány obsahují receptory a pumpy podobně jako plasmalema a jiné organely: angiotensin II R, IP 3 R, RyR, Na +, K + i Ca 2+ pumpy. Vnější jaderná membrána také obsahuje ribosomy a je napojena na ER. Přes obě membrány prochází jaderné póry (strukturně podobně gap junctoin), z nichž směrem do cytoplasmy vystupují cytoplasmatická vlákna; směrem do nuleoplasmy tvoří podobná vlákna tzv. jaderný košíček (nuclear basket). Jaderné póry obsahují velký iontový kanál (průměr 10 nm s vodivostí asi 500 pS), kterým prochází i makromolekuly. Z hlediska toku iontů můžeme měřit a) toky různými receptory, b) toky iontovými kanály či c) toky jadernými póry. Pór tedy buď může vést jako iontový kanál, nebo může být uzavřený, nebo může být „ucpaný“ (plugged) průchodem nějaké makromolekuly. vnitřní jaderná membrána vnější jaderná membrána jaderný pór malé iontové kanály pumpy: Na +, K + i Ca 2+ receptory

8 roztok elektrody patchová ME jádro fluorescenční sondy patchová ME Patch clamp jaderného obalu – mikroskopický přístup Jaderný obal je daleko složitější než plasmatická membrána. Pozorovaný tok iontů (naměřený proud) může pocházet z toků přes kanály receptorů, z IKs i z toků přes jaderné póry. Co (z čeho) tedy vlastně měříme? aneb „Rosettská deska jaderné elektrofyziologie“: Jen tehdy, když prokážeme, ze jaderné póry jsou zavřené nebo „ucpané“, můžeme říci, že naměřená proudová aktivita nepochází z nich. Jen tak lze pochopit vztah mezi nukleocytoplasmatickým transportem makromolekul zprostředkovaným jadernými póry a mezi aktivitou iontových kanálů zaznamenanou z jaderného obalu.“ Jsou póry uzavřené (a s nimi i IKs) nebo ne?  malé fluorescenční sondy (4 kD dextran – 5.4 nm dendrimer) aplikované cytoplasmaticky Podobně lze vystopovat transportní aktivitu jaderných pórů: makromolekula určená pro jádro (obsahující nuclear localization signal, NLS) aplikovaná cytoplasmaticky je fluorescenčně označena (240 kD B-fykoerythrin konjugovaný s NLS T antigenu SV40)  

9 patchová ME elektrody makromolekula jaderný pór malé iontové kanály vnější jaderná membrána vnitřní jaderná membrána cisterna čas  proud zaznamenaný z jaderné obálky 10 kanálů s velkou vodivostí 416 pS proud zaznamenaný z jaderné obálky 1 kanál s velkou & 1 kanál s malou vodivostí 362 & 91 pS otevřeno zavřeno baseline kapacitní artefakt velká vodivost malá vodivost 2 s napěťové pulsy Příklady záznamů proudů z jaderné obálky pořízené na jádrech z Dunning G buněk rakoviny prostaty. (pořídil J.O. Bustamante, www.geocities.com/jobustamante) Histogramy vodivostí jaderného obalu z různých experimentů. Relativní „šířka“ základny hrotů každého histogramu je úměrná velikosti vodivosti, tj. počtu současně otevřených kanálů v jaderné membráně.

10 Technika „přesýpacích hodin“ - nuclear hourglass technika (NHT) – makroskopický přístup Při technice „přesýpacích hodin“ není pipeta přisáta na jádro, ale jádro je umístěno v lumen kapiláry, kterou de facto elektricky ucpává díky odporu jaderných obalů. Na jedné straně kapiláry je injikován proud, I injected, a na druhém konci je měřen pokles napětí, V measured. Z těchto hodnot (Ohmův zákon!) je vypočítán odpor systému, R measured. Jde tedy o nepřímé stanovení odporu (a tím i vodivosti) jaderných obalů – „únikových“ proudů přes jaderné obaly, přes periferní iontové kanály, přes jaderné póry aj. Studuje např. předpokládané toky proudů periferními kanály, pokud jsou jaderné póry (a s nimi IKs) uzavřeny nebo „ucpány“. Dobrý NHT experiment je takový, kdy lumen krčku kapiláry má průměr menší než je průměr jádra. Tak dostaneme dvě „půlky“ jaderných obalů v přímém kontaktu s roztokem v kapiláře. Vodivost roztoku (fyziologického) i nukleoplasmy (  ) je zhruba shodná, asi 13 mS/cm. Spolu s dalšími parametry (šířkou štěrbiny w, její délkou L, odporem prostoru vymezeného jádrem R replaced aj.) tvoří vzorec na výpočet odporu/vodivosti jaderných obalů R N/E. patchová ME štěrbina jádro štěrbina jádro kapilára vs. Pokud např. v roztoku nahradíme K + Cs + a Cl - F -, můžeme studovat čistě Na + periferní proudy (za současné blokády jiných kanálů). Otázky typu: Jak souvisí tok iontů přes různé periferní kanály s transportem makromolekul z/do jádra? Jakými toky iontů jádro signalizuje do cytoplasmy? aj. R replaced = L  -1  -1 r -2 R shunt = L  -1  -1 (r -2 – (r-w) 2 ) -1 R nucleus = R NE + R intranuclear R intranuclear = L  -1  -1 (r-w) -2 R N/E = ((  R+R replaced ) -1 –(R shunt -1 ) -1 - R intranuclear

11 B) Membránové potenciály rostlinných buněk AP se šíří asi 1000x (zhruba 0,05 cm/s až jednotky cm/s – ale pozor, jsou prý i rekordmani se 40 m/s) pomaleji a trvá až 1000x déle (pomalejší kinetika rostlinných IKs); rychlost šíření závisí na tom, co AP vyvolalo je přenášen nespecializovanou tkání, via plasmodesmata či buňky floému má jiné iontové základy: využívá vtok Ca 2+, výtok Cl - a K + mnoho rostlinných AP nemá žádnou zřejmou komunikační funkci Rostliny vykazují podobné potenciálové změny na membráně jako živočichové. Jsou schopny kolísání membránového potenciálu i vzniku a šíření potenciálu akčního (AP), což může být zaznamenáváno elektrodami na povrchu rostliny, vsunutými do jejich orgánů či např. patch clampem. Podobně jako u živočichů, jsou rostlinné AP spuštěny po překročení prahové úrovně (u sojových bobů je to asi  30 mV), jsou odpovědí typu „všechno nebo nic“, mají refraktrerní periodu. Rostlinné AP mají ale také několik zásadních odlišností: S excitabilitou rostlinných buněk/tkání souvisí schopnost rostlin synchronizovat jejich vnitřní biologické procesy a odpovídat na změny okolního prostředí. Bioelektrické signály jsou nejrychlejší cestou, jak předat nějaký signál mezi orgány rostliny na větší vzdálenost (vs. difuse...). Rostliny rychle odpovídají na změny ve světelné intenzitě, osmotickém tlaku, elektromagnetickém či gravitačním poli, teplotních poměrech. Reagují na poranění, mechanickou stimulaci, dostupnost vody. AP rostlin aktivují membránové enzymatické systémy spouštějící další kaskády, zrychlují produkci ethylenu, zvyšující koncentraci inhibitorů proteas (sazenice rajčat při ohryzu hmyzem – tomu pak inhibitory proteas brání v trávení), zvyšují „gelovatost“ cytoplasmy (Chara: nevyteče jí pak případnou dírou ven) či upravující rychlost produkce proteinů.

12 Měření membránových a akčních potenciálů: problém celulózové buněčné stěny Příprava protoplastů (tady z růstového konce Nitella expansa – příprava „klasického obřího protoplastu“)  Protoplasty izolované z kořenových buněk mrkve stejným postupem. (A)enzymatické natrávení buněčné stěny (1% celulasa Onozuka R-10, 0,05% Macroenzyme Onozuka R-10, 1,0 mM CaCl 2, 0,1 mM KCl, patřičná osmotická koncentrace dotažena sorbitolem, pH5,5) (B)1 hod inkubace. (C)2 hod inkubace isolované protoplasty klesají na dno komůrky. (D)Čerstvě připravené protoplasty mají nepravidelné tvary, tok cytolasmy dočasně ustal.

13 Měření membránových a akčních potenciálů: přímé intracelulární měření s penetrací buněčné stěny Lze použít i přímé intracelulární měření (skleněné ME s hrotovým odporem 1-10 M  a plněné 1,5 M KCl), např. na mladých rostlinách Chary (parožnatka?), ze které se jinak standardně připravují „obří“ rostlinné protoplasty k patch-clapmovému nebo intracelulárnímu snímání. Klidový membránový potenciál Chary je až překvapivě nízký, běžné jsou hodnoty kolem –250 mV. Je tomu tak nejen díky poměru koncentrací K + uvnitř a vně buňky, ale i díky přítomnosti protony pumpujících ATPas. Amplituda AP Chary je až několik set mV (díky značným hnacím silám iontů). 162.012.0103.034.0Vakuola 22.00.0015.0110.0Cytplasma 0.40.1 Rybniční voda [Cl - ][Ca 2+ ][Na + ][K + ] Iontové koncentrace v mM. V tabulce uvedené koncentrace iontů jsou podkladem těchto hodnot rovnovážných (Nernstovských) potenciálů: E K = -177 mV, E Na = -99 mV E Ca = +58 mV, E Cl = +100 mV Cl - (a Ca 2+ ) tedy přispívají k depolarizaci. AP Chary se vlastně skládá ze dvou potenciálových změn: první „jde“ AP plasmalemy, druhý AP tonoplastu. Pokud vložíme ME do vakuoly, zaznamenáme sice jen jeden AP, ale ten obvykle má rychlou (influx Ca 2+ do buňky) a pomalou (Ca 2+ navozený Cl - eflux přes obě membrány) depolarizační složku.

14 Měření membránových P a AP na protoplastu: zavedení elektrody Ca 2+ cytoplasmatonoplast plasmatická membrána vakuola 1. Skleněná ME je přiložena k protoplastu a je aplikován krátký elektrický puls (5 ms). Bezprostředně poté vznikne v membráně protoplastu dírka, viditelná pod malým zvětšením ve světelném mikroskopu. Při vhodné koncentraci iontů Ca 2+ během několika sekund dírka dosáhne průměru několika mimkrometrů. Rozrůstání dírky je doprovázeno pohybem ektoplasmy (vrstvy chloroplastů) a je dobře vidět jako bílá tečka na zeleném povrchu protoplastu. Během několika vteřin od aplikace pulsu pohyb cytoplasmy ustává. 2. Předtím, než se dírka uzavře, je elektroda vsunuta dovnitř. Otevření dírky napomáhá zvýšená koncentrace Ca 2+. 3. Elektroda se nechá několik minut v klidu na místě, aby došlo k uzavření dírky. 2.3. 1. 4. Postupně se obnoví proudění cytoplasmy (ustane vtok Ca 2+, který aktivoval proteinkinasu bránící interakci aktinu a myosinu) a membránový potenciál klesne k původním velmi negativním hodnotám. Záznam rostlinného AP pořízený ME vsunutou tímto způsobem. Depolarizační vlna na konci záznamu představuje kalciový proud. nebo

15 Rostlinné AP byly prvně detekovány v rostlinách vykazujících rychlé pohyby (thigmonastické r.) jako mucholapka (Dionaea muscipula, Venus flytrap), rosnatky (Drosera spp., sundew) ci citlivka (Mimosa pudica,“sensitive plant“). Jejich APs vznikají v orgánech citlivých na dotek, šíří se nespecializovanými buňkami a vyvolávají pohyby v jiných oblastech rostliny. (Spouštěče AP jsou obecně velmi často mechanicky ovládané IKs (statolithové buňky v kořenech). Dojde k otevření IK, toku iontů, lokální depolarizaci otevírající sousední napěťově ovládané IKs... kompletní depolarizace a vznik AP.) Citlivka: AP vyvolaný dotekem se šíří rychlostí 5 cm/s až k tzv. pulvinu (sg. pulvinus) na bázi lístečku. Tam vyvolá výtok draselných iontů. K + je následován vodou, dojde k poklesu osmotického tlaku a ztrátě turgoru. Lísky zkolabují a obnaží trny  ochrana před herbivory. Mucholapka: AP je vyvolán, pokud se (eventuální) kořist dotkne 2x během 30 s (neplýtvá se energií na kapky vody při dešti či spadlé lístky) spouštěcích vlásků na vnitřní straně lístků (! – ty na okraji slouží jako filtr, nechají uletět příliš malou kořist). Princip stejný jako u citlivky.  přísun dusíkatých živin i na chudých substrátech V případě AP u jediné buňky jsou zřejmě (rostlinné) AP nutné pro opravu porušené membránové integrity. Uvědomte si, ze transmembránový potenciál o hodnotě –100 mV představuje na membráně o šířce 10 nm potenciálový gradient 10 MV/m. Pokud by se tento gradient „nevybil“ akčním potenciálem, tok iontů přes malé poranění by byl příliš rychlý na to, aby vůbec došlo k opravě. Toto mohlo být prazákladní rolí AP v jednobuněčných organismech; až sekundárně došlo ke komunikačnímu využití AP u mnohobuněčných.

16 Volkov a Haack studovali šíření elektrických signálů v rostlinách napadených herbivorním hmyzem, v tomto konkrétní případě lilek brambor napadený larvami mandelinek. Po 6-10 hodinách od nasazeni larev vznikly a šířily se APs s amplitudou 40 ± 10 mV a pomalým šířením. Rychlost šíření AP nezávisí na poloze pracovních elektrod ani na vzdálenosti pracovní a referenční elektrody. Lze ji určit ze směrnice přímky popisující časovou závislost velikosti časového úseku mezi dvěma naměřenými vrcholy AP na vzdálenosti elektrod. V tomto případě je to asi 0,05 cm/s. Akční potenciály ve stonku brambory napadené larvami mandelinek na mladých koncových lístcích. Vzdálenost mezi elektrodami: (a) 3,5 cm; (b) 12 cm; (c) 22 cm; (d) 20 cm. referenční Ag/AgCl elektroda byla vsunuta do stinku, pracovní Ag/AgCl elektrody byly také ve stonku (a, b, c) nebo v hlíze (d). a čas / s 0 100 200 300 400 500 600 700 0 25 50 -25 -50 MP (mV) b čas / s 0 100 200 300 400 500 600 700 0 25 50 -25 -50 MP (mV) c čas / s 0 100 200 300 400 500 600 700 0 25 50 -25 -50 MP (mV) d čas / s 0 100 200 300 400 500 600 700 0 25 50 -25 -50 MP (mV)

17 Stanković and Davies, Planta (1997) 202, 402-406. Rostliny rajčete byly stimulovány elektrickými pulsy nebo popálením na listu 3. Záznamové elektrody byly vsunuty do listu 2 a do listu 4, který byl také následně odebírán na analýzy. Stimulované rostliny odpovídaly elektrickými signály, které v důsledku vedly k produkci inhibitoru proteas pin. Po stimulaci vzrostla produkce pin mRNA 5-15krát. Rostliny, které negenerovaly žádné signály, měly hladinu pin mRNA nezměněnu. Je zřejmě výhodnou rostlin, že mohou rozlišovat mezi různými stimuly a vybrat si vůči nim odpovídající typ odpovědi. Různé touch-geny (např. pro kalmodulin) mají několik promotorových sub-regionů, které různě odpovídají na teplo, chlad, gravitaci, dotek a auxin. a b c d e f 50 mV 1 mm Přímé elektrické navození exprese pin1. Hodinu po stimulaci listů 3 byly odebrány listy 4 a stanoveny hladiny transkriptů pin1 (autoradiografy). Dvojitá kolmá čára je doba stimulace. a, kontrolní rostliny se vsunutými elektrodami, ale nestimulovány. b-e, elektricky stimulované rostliny. f) popálené rostliny PIN 1 mRNA a b c d e f 0 0,5 1 2 0 1 2 doba od stimulace (h) PIN 1 CAL1 světlotma Kinetika exprese pin 1 a cal 1 za různých světelných podmínek po poranění (popálení). Kinetika exprese pin 1 a cal 1 u popálených rostlin udržovaných při stálém mírném osvitu. 0 0,25 0,5 1 2 6 doba od stimulace (h) PIN 1 CAL1

18 20 0MP (mV) 40 8214 8215 8216 b čas / s 20 0MP (mV) 40 280285 c čas / s 4297 4298 4299 20 0 -20 -40 MP (mV) a čas / s V atmosféře probíhá mnoho chemických reakcí různých plynů a kapalnou vodou a rozpuštěnými elektrolyty. Takto vzniká např. kyselina dusičná z oxidů dusíku. Mraky konvertují 50-80% oxidu siřičitého na kyselinu sírovou, což přispívá ke vzniku kyselých dešťů s pH pod 5,6. Cca 70% podíl kyselých složek kyselých dešťů představuje kyselina sírová, 30% podíl kyselina dusičná. Modelové zasažení „kyselým deštěm“ vyvolá akční potenciál – rostlina je informována o tom, co se děje. Potenciálové rozdíly – akční potenciály mezi pracovními elektrodami ve stonku sojového bobu (a) 1 hodinu, (b) 15 hodin a (c) 48 hodin po postříkání rostliny 0,1 mL 0,05 M kyseliny sírové,

19 C) Bioelektrické jevy v nervových a svalových buňkách Chování kanálů Chování kanálů lze popsat více proměnnými: dobou, po kterou jsou v otevřeném/zavřeném stavu a rychlostí, s jakou přechází do jednotlivých stavů, vodivostí kanálu, propustností kanálu, specifitou pro určité ionty... Kanály mohou existovat nejen ve stavu otevřeném a zavřeném, ale i v několika dalších mezistavech.... může existovat např. v těchto dvou různých vodivostních stavech...... nebo může rychle přecházet mezi stavem otevřeným a zavřeným (flicker)...... nebo se může otevírat v několikasekundových salvách proložených tichem...... a tyto salvy se mohou sdružovat do skupin. McBurny Trends in Neurosci (1983), 6, 298-302 Jeden acetylcholinový receptor (AChR)... Otevření a doba otevření jednoho IK závisí na mnoha faktorech. Za konstantní koncentrace agonisty se IK otevře mnohokrát za sebou, a to náhodně (podle toho, jak naráží agonista na IK). Postsynaptická membrána obsahuje různě velkou populaci různých IKs, a pokud se sečtě náhodné otevírání těchto kanálů, dostaneme proud kolísající kolem průměrné hodnoty I.

20 0 mV 2 0 - 2 proud (pA) ven dovnitř 2 0 - 2 proud (pA) ven dovnitř 20 mV 2 0 - 2 proud (pA) ven dovnitř -20 mV 020406080100 čas (ms) napětí (mV) proud (pA) Chování kanálů I-V diagram: směrnicí této přímky je vodivost kanálu (  ), tady 110 pS draslíkové kanály v outside-out terčíku v roztoku 150 mM K + nT + nR(  c )  nTR(  o ), kde   Chování populace IKs v membráně lze popsat vztahem (McBurny, 1983) T = molekuly agonisty, R = receptorová místa,  c = vodivost zavřeného kanálu,  o = vodivost otevřeného IK a n je počet molekul agonisty, který se musí navázat na R aby otevřely IK s rychlostní konstantou . Je-li IK otevřen, jeho vodivost vzroste (  o -  c ). Po inaktivaci nebo odpoutání agonisty se kanál zavírá s rychlostní konstantou . Velikost proudu proteklého kanálem je dána jeho vodivostí a hnacími silami iontů. Různí agonisté a antagonisté mohou tok iontů kanálem ovlivňovat různými způsoby - zvyšovat počet otevřených IKs, ovlivňovat , průměrnou dobu otevření IK nebo jeho vodivost. Možná toto je důvod, proč NS používá tolik různých přenašečů: např. glutamát na žabím svalu otevírá kanály s  =1,4 ms, zatímco aspartát s  =0,8 ms. Proud protékající kanálem je měřítkem toho, jak rychle se ionty kanálem pohybují. Velikost proudu nezávisí jen na vlastnostech kanálu, ale i na velikosti (trans)membránového napětí. Velikost tohoto proudu lze vynést jako funkci napětí:

21 draslíkové kanály v outside-out terčíku v roztoku 3 mM K +, v pipetě 90 mM K +  simulace intra-a extracelulárního prostředí, E K = -85 mV Chování kanálů 0 mV 20 mV -50 mV -100 mV 5 pA otevřený zavřenýproud (pA) napětí (mV) Vodivost kanálu závisí na (i) snadnosti, s jakou procházejí ionty kanálem, tj. vnitřní vlastností kanálu zvanou propustnost, a na (ii) koncentraci iontů v okolí kanálu. Pokud není aplikován žádný potenciál, teče kanálem proud asi 4 pA, zatímco při –85 mV je tok = 0. Proud tekoucí kanálem je určen ne V m, ale rozdílem V m a E K. Tento rozdíl je elektrickou hnací silou iontu přes kanál. Na tomto příkladu je hnací síla V m – E K rovna +85 mV. Bod zvratu (revrsal potential, V r ): je hodnota potenciálu, při které se proud mění z dovnitř tekoucího na ven tekoucí: I-V závislost není lineární: pokud jdeme od rovnovážného potenciálu směrem k depolarizačním hodntám, roste proud mnohem rychleji, než kdybychom šli k hodnotám hyperpolarizačním. Vodivostje závislá na koncetracích iontů: vně „buňky“ je koncentrace vyšší, je tam tedy více iontů schopných nést „dovnitř“ tekoucí proud. Čím více se od rovnovážného potenciálu vzdalujeme, tím je tento efekt výraznější. Nelineární I-V grafy se vyskytují u usměrňujících kanálů. Jejich propustnost je napěťově závislá, dovolují protékat iontům v jednom směru více než v jiném. Př.: dovnitř usměrňující K + IK, tvz. inward rectifier channel. K+ teče o buňky, je-li V m negativní vzhledem k E K, ale jen minimálně či vůbec vytéká z buňky, pokud je rozdíl v potenciálech opačný. Podobně nelineární závislost mají třeba synaptické proudy na nervosvalovém spojení. V r nemusí být vždy kolem nuly; na NMJ byl původně stanoven na –15 mV.

22 Chování presynaptické membrány: exocytosa Elektrofyziologicky lze monitorovat např. i procesy exocytosy či endocytosy v živých buňkách. Fúze jednoho váčku s neuropřenašeči můžeme detekovat jako malý vzrůst kapacity membrány – přechodně se zvýší plocha membrány (RC členu). Analogicky, „zaškrcení“ vylitého váčku a jeho vtažení zpět do buňky se projeví jako pokles kapacity membrány. Asi 15% výlevů se projeví jako přechodné, neúplné zvýšení kapacity membrány – v těchto případech se exocytosa zřejmě realizuje způsobem „kiss-and- run“, vzniká malý přechodný pór a membrán váčku vlastně s membránou terminály neplyne. Váček se po znovunaplnění rychle vrací „do oběhu“. Takto se vylévají katecholaminy (malé molekuly obecně), látky snadno a rychle nahraditelné (oproti např. velkým proteinům, jejichž výlev je podmíněn syntézou kompletně nových váčku v Golgiho aparátu). Kapcita (fF) Čas (min) 01234 50 100 150 Výlev Kapcita 20 pA 20 fF

23 D) Studium vztahů pre- a postsynaptických dějů Vztah mezi presynaptickými akčními potenciály a postsynaptickou odpovědí lze studovat např. jako vztah mezi membránovým potenciálem presynaptického zakončení a množstvím uvolněného neuropřenašeče. Uvolněná kvanta neuropřenašeče (je-li excitační) vyvolají excitační postsynaptické potenciály (EPSP), které v součtu mohou překročit práh pro vznik AP. postsynaptické vlákno stimulus pretsynaptické vlákno post- pre- ganglion stellatum sépie synapse 0 10 20 30 40 50 60 70 Amplituda postsynaptické odpovědi (mV) 0 5 10 15 20 Presynaptické impulsy Presynaptické impulsy po kompletním TTX bloku Amplituda presynaptické depolarizace (mV) Při použití TTX klesá během cca 15 min amplituda AP vyvolaného stimulací až k nule. S poklesem amplitudy AP (navozené depolarizace) se snižuje i množství uvolňovaného neurotransmiteru  klesá amplituda EPSP, až nedosáhne v součtu prahu pro vyvolání postsynaptického AP. post- pre- + TTX 0 min 15 min S poklesem amplitudy presynaptického AP začne rychle klesat postsynaprická odpověď. Pokles amplitudy presynaptického AP pod 45 mV už prakticky žádnou postsynaptickou odpověď nevyvolá. TTX neovlivňuje citlivost postsynaptické membrány k neuropřenašeči, takže podstatou je jen redukce vylitého kvanta. Katz a Miledi 1967 J Physiol 192: 407-436 Pro vznik AP nejsou dostatečné toky Na+ a K+, spouštěčem je depolarizace. Umělá stimulace s různou amplitudou má tytéž rysy.

24 Během depolarizace se zvyšuje propustnost membrány pro Ca 2+ a ten vstupuje do buňky. Při zablokování sodíkových (TTX) a draslíkových (TEA) proudů lze proudy vápníkové měřit odděleně. Ca 2+ a výlev na synapsi 120 0 -70 -20 0 400 4 ms Presynaptický potenciál (mV) Postynaptický potenciál (mV) Presynaptický Ca 2+ proud (nA) 1 ms Membránový potenciál (mV) -20 -40 -60 -80 0 20 Ca 2+ proud (nA) 500 0 Depolarizace na –18 mV vyvolá dovnitř tekoucí Ca 2+ proud o velikosti as 400 nA. V postsynaptické buňce naměříme vysoký EPSP. Při depolarizaci na +60 mV (do blízkosti rovnovážného potenciálu pro vápník) je vlna Ca 2+ proudu potlačena a a na postsynaptické membráně téměř žádný EPSP nevidíme. Depolarizace nervového zakončení není dostatečným faktorem pro spuštění výlevu – musí také dojít ke vstupu Ca 2+ do terminály. Pokud vyvoláme „umělý“ AP (s parametry získanými např. při záznamu „normálního“ AP a následně -voltage clamp!- „puštěnými“ terminále) v roztoku s TTX a TEA, dostaneme standardní postsynaptickou odpověď a standardní záznam vápníkového proudu. Sodíkové a draslíkové proudy, které normálně doprovázejí AP, nejsou dosatečnou podmínkou pro vyvolání výlevu -musí také dojít ke vstupu Ca 2+ do terminály. Llinás, R. 1982 Sci Am 274(4): 56-65

25 Ca 2+ a výlev na synapsi Ca 2+ vstupuje do terminály v blízkosti místa výlevu. Pokud použijeme různé chelátory vápníku se stejnou pufrační kapacitou, ale rozdílnou rychlostí působení, a zaznamenáváme po dobu 4 ms postsynaptickou odpověď, dostaneme různé obrázky: BAPTA EGTA pretsynaptický záznam postsynaptický záznam 1 ms Ca 2+ Který chelátor působí rychleji? Adler et al. 1991 J Neurosci 11: 1496-1507

26 Ca 2+ a výlev na synapsi Mikrodomény Ca 2+ v presynaptickém zakončení obřího axonu sépie jsou různé v klidu a po příchodu presynaptického akčního potenciálu. Zatímco v klidu lze pzorovat roztroušené ostrůvky s poměrně nízkou koncentrací kalcia, po krátké salvě APs hladina Ca 2+ v zakončení výrazně vzroste. Dochází k masivnímu výlevu váčků s neuropřenašeči. NSF synaptotagmin SNAPs Ca 2+ IK Unc-18 VAMP SNAP-25 Rab-3A RIM synatxin

27 Co si pamatovat z dnešní přednášky - příklad elektrofyziologie organel (mitochondrie, jádro) - odlišnosti AP rostlin od AP živočichů - příklady bioelektrických jevů v rostlinách - vodivost kanálu, bod zvratu - vztah pre- a postsynaptických událostí - role vápníku při výlevu váčku