Experiment: Test na přítomnost patogenu ve vodě z mytí brambor pomocí PCR.

Prezentace na téma: "Experiment: Test na přítomnost patogenu ve vodě z mytí brambor pomocí PCR."— Transkript prezentace:

1 Experiment: Test na přítomnost patogenu ve vodě z mytí brambor pomocí PCR

2 Vodu z mytí brambor použijeme k naočkování LB (Luria-Bertani) media. Další testy budeme provádět s izolovanými koloniemi, které se na tomto médiu objeví.

3 1. Extrakce DNA

4 1.1. Pipetujte 50μL sterilní destilované vody do sterilní mikrozkumavky (P1) Pozor! Suspenze musí být homogenní! 1.3.V mikrozkumavce (P1) rozmíchejte bakteriální materiál – vytvořte suspenzi 1.2.Kalibrovanou 1μL sterilní kličkou odeberte bakteriální kulturu

5 1.4.Inkubujte mikrozkumavku (P1) do vodní lázně při 100°C na 1 minutu. 1.5. Vložte mikrozkumavku (P1) do centrifugy. 1.6. Odstřeďujte mikrozkumavku (P1) po dobu 5 minut při 4500 otáčkách za min. 1.7. Vyjměte zkumavku a přeneste supernatant s DNA do další sterilní mikrozkumavky (P2).

6 2. Příprava směsi pro PCR (M)

7 2.1. Do sterilní mikrozkumavky pipetujte: 90 µL sterilní destilované vody  50 µL pufru 10X  28 µL MgCl2 25mM  28 µL dNTP 0,2µM  4 µL Taq polymerázy 2.2. Pokud PCR neprovádíte během dne přípravy směsi, je nutné směs zmrazit! 2.3. Před použitím rozmrazte a krátce odstřeďte. ! směs pro PCR je již připravena !

8 3. Amplifikace DNA

9 3.1. Do mikrozkumavky (A) pro PCR pipetujte 10µL roztoku DNA z mikrouzkumavky (P2). 3.2. Přidejte 20µL PCR mix (M). 3.3. Přidejte 10µL každého primeru metkRPECTO a metkFPECTO nebo 16SR a 16SF. Promíchejte svůj roztok opakovaným pipetováním a vypouštěním! Je možné použít oba páry primerů současně. Objemy primerů jsou potom 5μL.

10 3.4. Mikrozkumavku (A) krátce odstřeďte. 3.5.Vložte mikrozkumavku (A) do termocykleru. Poznačte si její umístění! T°C Nb cycles

11 3.6.Připravte dva kontrolní vzorky – zopakujte kroky 3.1. až 3.5., přitom nahraďte roztok DNA (P2):  Vodou pro negativní kontrolu (C-)  Roztokem DNA Pectobacterium atrosepticum pro pozitivní kontrolu (C+) Kontrola amplifikace DNA

12 5`, 72 °C dokončení 30``, 94 ° denaturace 40 cyklů 5`, 96°C denaturace 30``, 58°C navázání 30``, 72 °C elongace 3.7. Nastavte termocykler : 96°C, 5min 40 cyklů : 94°C, 30s 58°C, 30s 72°C, 50s 72°C 5min Skladujte při 4°C 3.8. Spusťte amplifikaci. T°C Nb cycles

13 4.Electroforéza fragmentů DNA

14 4.1. Do tří sterilních mikrozkumavek (E1, E2, E3), pipetujte 10μL roztoku PCR (A, C-, C +). 4.2.Přidejte 2μL nanášecího pufru (X) a zamíchejte.

15 4.3.Z gelové kazety odstraňte ochranný obal. 4.4. Vypláchněte jamky demineralizovanou vodou. Nakloňte kazetu – vylijte přebytečnou tekutinu a kazetu opatrně vysušte.

16 4.5.Do jamky pipetujte 5 µL testovaného roztoku E1. 4.6.Do vedlejších dvou jamek potom 5 µL kontrolních roztoků E2 a E3. 4.7.Do čtvrté jamky pipetujte 5µL roztoku molekulárních markerů (W)

17 4.8.Spusťte elektroforézu a nechejte ji probíhat po dobu 10 min při 220V. 4.9.Vypněte zařízení v okamžiku, kdy první proužky roztoku molekulárních markerů doputují na konec gelu.

18 5.Analyzujte vaše výsledky