Vyšetřování parametrů humorální imunity

Prezentace na téma: "Vyšetřování parametrů humorální imunity"— Transkript prezentace:

1 Vyšetřování parametrů humorální imunity

2 Imunochemické metody řada metod založených na principu reakce:
antigen (Ag) + protilátka (Ab) → imunokomplex (IK) stanovujeme buď Ag nebo Ab (obecně analyt)

3 Vyšetřování humorální imunity
Imunoprecipitace v roztoku - Nefelometrie - Turbidimetrie Imunoprecipitace v gelu - Imunodifuze Elektroforéza Aglutinace (Ag – korpuskulární charakter; IgM, IgG) Komplementfixační testy (Ab+Ag+komplement) Imunoreakce se značenými protilátkami (EIA, ELISA, RIA) Imunobloting (southerblot, notherbloting,westernbloting) imunofluorescence

4 Imunoprecipitační křivka

5 Zákalové metody: nefelometrie a turbidimetrie
Použití: používá se prostanovení vzorků o vyšších koncentracích proteinů stanovení množství (koncentrací) běžných proteinů lidského séra (jednotlivé třídy Ig, CRP, RF, složky komplementu C3 a C4, C1 INH)

6 Nefelometrie ↑ Z →→→→ K (Ag-Ab) ↓ D
Princip: základem metody je měření intenzity odraženého světla od zákalu vzniklého reakcí Ag – Ab. Z – zdroj (laser, výbojka) K – kyveta se vzorkem D – detektor D ↑ Z →→→→ K (Ag-Ab) ↓ D

7 Nefelometrie Vyhodnocení: dle kalibrační křivky sestavené pomocí standardu (Ag o známé koncentraci) a získaných odpovídajících hodnot intenzity odraženého světla intenzita odraženého světla koncentrace Ag

8 Turbidimetrie Princip: měří úbytek intenzity světla po jeho
průchodu kyvetou obsahující IK Zdroj – Kyveta – Detektor jsou umístěny v jedné přímce: Z →→→→ IK (Ag-Ab) → D Vyhodnocení: dle kalibrační křivky

9 Radiální imunodifuze Postup: gel smícháme s Ab → inkubace s Ag → Ag difunduje do okolí a tvoří s Ab imunokomplexy (IK) → prstencový precipitát Hodnocení: změří se průměr prstence a koncentrace Ag se odečte na kalibrační křivce Použití principu RID: stanovení celkové hemolytické aktivity komplementu, funkční test C1 INH

10 Jednoduchá radiální imunodifuze
( S1 – S7 – standardy, V1 – V2 – vzorky)

11 Dvojitá imunodifuze Ouchterlony
pasivní dvojitá imunodifuze - difunduje Ag i Ab používá se pro stanovení extrahovatelných jaderných antigenů Identické antigeny neidentické antigeny částečně identické antigeny

12 Aglutinace (shlukování)
Antigen v této reakci má korpuskulární charakter (např. erytrocyt, bakterie, Ag navázaný na latexové častici…) Protože protilátka (IgG, IgM) má více vazebných míst, dochází ke shlukování částic či buněk na jejichž povrchu je lokalizovaný Ag

13 EIA – enzyme immunoassay
skupina metod Společný princip: použije se Ag nebo Ab značená enzymem (Ag*, Ab*) → po navázaní s hledaným Ag nebo Ab ze vzorku je tak enzymem označen celý IK (Ag-Ab*, Ab-Ag*) → enzym reaguje s přidaným substrátem za vzniku výsledného produktu, který detekujeme Vyhodnocení: pomocí kalibrační křivky (Ag o známé koncentraci – standardy- a k nim změřené vlastnosti produktu – př. intenzita zbarvení) Použití: kvantitativní stanovení malých množství některých proteinů (př. specifických Ab, hormonů, cytokinů, TU markerů...)

14 EIA – enzyme immunoassay
Dělení EIA metod: a) dle typu enzymu, substrátu a detekce výsledného produktu: ELISA (fotometrická detekce barevného produktu) FEIA (fluorometrická detekce fluorescence výsledného produktu) LEIA (luminometrická detekce světla uvolněného/emitovaného při změně chemické struktury substrátu) b) dle postupu: heterogenní x homogenní kompetitivní x nekompetitivní

15 EIA – enzyme immunoassay
ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay = heterogenní nekompetitivní sandwichová ELISA vícevrstevnatá (sandwichová) metoda – analyt (Ag nebo Ab), je v konečné fázi vázán mezi dvěma vrstvami: Ab-Ag-Ab* nebo Ag-Ab-Ab* Princip: pevná fáze je pokryta př. Ag → přidáme vzorek s hledanou Ab → tvorba IK (Ag - Ab) → promytí → přidáme konjugát, tzv. „sekundární Ab“ → vzniká komplex Ag-Ab-Ab* → promytí → přidán substrát → enzymatická reakce → vznik barevného produktu

16 ELISA Hodnocení ELISA: fotometr měří absorbanci (intenzitu zbarvení) vzniklého barevného produktu. Intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci vyšetřovaného vzorku a příslušná hodnota se odečítá pomocí kalibrační křivky

17 ELISA

18 ELISA

19 ELISA

20 EIA – enzyme immunoassay
Pozn: FEIA – fluoroenzymoimunoanalýza - výsledkem reakce je fluoreskující produkt hodnocení: dle kalibrační křivky! - fluorometr měří intenzitu fluorescence použití: př. stanovení specifických IgE LEIA – luminoenzymoimunoanalýza – výsledkem reakce je změna chemické struktury substrátu - způsobí uvolnění fotonů - světélkování hodnocení: dle kalibrační křivky! - luminometr měří intenzitu emitovaného světla použití: př. stanovování hladin specifických IgE, ECP, některých hormonů, TU markerů atd.

21 RIA – radioimunoanalýza
Princip: Ag nebo Ab se značí radioaktivním isotopem (rozdíl od metody EIA)→ následně označen IK vysoká citlivost a specifičnost nevýhoda: vyšší nároky na technické vybavení, bezpečnost práce Použití: př. stanovování hladin některých hormonů, TU markerů, ...

22 Nepřímá imunofluorescence
Postup: 1. inkubace pacientova séra (Ab) se substrátem (Ag) fixovaným na podložním sklíčku 2. inkubace s anti-lidskou protilátkou značenou např. FITC (anti-human IgM/FITC, anti-human IgG/FITC, anti-human IgA/FITC) 3. detekce pomocí fluorescenčního mikroskopu

23 Nepřímá imunofluorescence