Stanovení exprese receptoru epidermálního růstového faktoru ( EGFR )

Prezentace na téma: "Stanovení exprese receptoru epidermálního růstového faktoru ( EGFR )"— Transkript prezentace:

1 Stanovení exprese receptoru epidermálního růstového faktoru ( EGFR )
Véghová B., Berkyová A., Kostelecká L. Ústav Patologie I.LF UK a VFN, Praha

2 Receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR)
Stanovení EGFR : → možnost moderní metody léčby nádorů na molekulární úrovni: vazba upravené protilátky a antigenu nádorové buňky zabrání jejímu dalšímu růstu, vede k apoptóze Léčebné využití : karcinom plic karcinom prsu karcinom tlustého střeva

3 Využití EGFR v léčbě kolorektálního karcinomu
V léčbě kolorektálního karcinomu se jeví jako nejslibnější zablokování části receptoru pro epidermální růstový faktor EGFR pomocí monoklonální protilátky Cetuximab Skupina EGFR bývá označována 1-4 Prvním popsaným receptorem této skupiny byl receptor pro epidermální růstový faktor označovaný jako EGFR (HER-1, erbB-1). Dalšími receptory jsou HER2/neu nebo erbB-2, HER-3 a HER-4.

4 Skupina EGFR

5 Set EGFR pharmDx (DakoCytomation)
Set obsahuje : primární protilátku proteinázu K blok peroxidázy negativní kontrolu labbeled polymer HRP DAB + chromogen, DAB + substrátový pufr promývací pufr kontrolní podložní skla obsahující dvě linie lidských buněk s hodnotami intenzity zabarvení 2 + a 0

6 Set EGFR pharmDx

7 Set EGFR pharmDx (DakoCytomation)
Všechna dodaná činidla jsou připravena speciálně pro použití s tímto testem, aby odpovídal uvedené specifikaci → nelze tedy používat žádné jiné Jsou také optimálně naředěna a jejich další naředění může způsobit ztrátu zabarvení antigenu Použití: vzorky fixované běžným způsobem a zalité v parafínu Cena: 38 335,- Kč bez DPH / 35 vyšetření

8 Set EGFR pharmDx (DakoCytomation)
Set uchováváme při teplotě + 4° až + 6°C Před prováděním metody musíme všechna činidla vyvážit na pokojovou teplotu, při které probíhá inkubace Zpracováváme současně tři podložní skla: vyšetřovaný vzorek s primární protilátkou negativní kontrola positivní kontrola Tkáňové řezy by měly být co nejtenčí, nejlépe na sklech se speciální úpravou: silan, poly-L-lysin, skla s nábojem .

9 Provedení reakce EGFR Deparafinace
Odhalení antigenních struktur proteinázou K proteolytický enzym Blokování endogenní peroxidázy 3% peroxid vodíku Primární protilátka myší monoklonální anti-lidský EGFR, klon 2-18C9 Sekundární protilátka značený polymer HRP Mezi těmito jednotlivými kroky důkladně oplachujeme skla v promývacím pufru

10 Dokončení reakce EGFR Vizualizace roztokem chromogenu DAB+
Dobarvení jader hematoxylinem Odvodnění Zamontování Kontrola kvality provedené reakce : positivní kontrola negativní kontrola

11 Hodnocení reakce Kvalitativní zhodnocení : 0 žádná pozitivita
1+ pozitivita - slabá 2+ pozitivita - středně silná 3+ pozitivita - silná Lokalita zbarvení : buněčná membrána cytoplazma membrána i cytoplazma

12 negativní 1+ 2+ 3+

13 Hodnocení pozitivní reakce
Heterogenní barvení : různá intenzita barvení v jednom nádoru (0 až 3+) zbarvení různých struktur membrán cytoplazmy nebo obou Homogenní barvení : zbarvení stejné intenzity zbarvení jen jedné struktury

14 EGFR protein je exprimován v řadě normálních tkání
CYTOPLAZMA : kůže tonzily plíce endometrium nadledviny BUNĚČNÁ MEMBRÁNA : kůže tonzily plíce endometrium jícen pankreas játra (hepatocyty) děložní čípek prostata

15 Vnitřní kontrola exprese EGFR
Pozitivní vnitřní kontrola u primárního tumoru: normální povrchové epitelie sliznice +/- slabá pozitivita perineurální fibroblasty Pozitivní vnitřní kontrola u metastáz v játrech: hepatocyty

16 Znázornění nespecifického pozadí
Difuzní nespecifické zabarvení tkáňových elementů Příčina - různé faktory BIOLOGICKÁ AKTIVITA TKÁNÍ pseudoperoxidázová reakce erytrocytů endogenní peroxidázová reakce granulocytů TECHNOLOGIE PROCESU chybná fixace tkáně inkompletní deparafinizace použití jiného pufru vyschnutí tkáně během barvení

17 Interpretační artefakty
Nepřiměřené proteolytické natrávení zhmoždění tkáně okrajový artefakt (zbarvení jen na periferii vzorku) retrakční artefakt (retrakce stromatu kolem nádorových buněk) termální artefakty (při odběru tkáně) - problém u endobiopsií nehodnotitelné oblasti nádoru nekrotické buňky izolované jen jednotlivé nádorové buňky špatně ukrojený nebo napnutý řez

18 Indikace k vyšetření exprese EGFR
Karcinom tlustého střeva metastazující i po standartní chemoterapii Při pozitivní expresi EGFR léčba ERBITUXEM (Cetuximab) – vyžadují Zdravotní pojišťovny Spádově vyšetření provádíme pro : Prahu Středočeský kraj Severočeský kraj

19 Vyšetření prováděná v našem ústavu
případů ( od zavedení metody ) případů případů případů ( za první pololetí ) Díky archivaci parafinových bloků můžeme vyšetřit i více než 10 let staré primární adenokarcinomy tlustého střeva nebo jejich metastázy (zejm. uzlinové, jaterní).

20 Děkuji za pozornost