SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ INFEKČNÍCH NEMOCÍ.

Prezentace na téma: "SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ INFEKČNÍCH NEMOCÍ."— Transkript prezentace:

1 SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ INFEKČNÍCH NEMOCÍ

2 LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA
INFEKČNÍCH NEMOCÍ: PŘÍMÝ PRŮKAZ MIKROORGANISMU NEBO JEHO PRODUKTU kultivace mikroskopie PCR

3 Dynamika protilátkové odpovědi IgG x IgM
NEPŘÍMÝ (SÉROLOGICKÝ) PRŮKAZ Stanovení protilátek obtížně kultivovatelné bakterie (lues, borelie aj.) retrospektivní nález (epidemiologie) Dynamika protilátkové odpovědi IgG x IgM

4 DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI
čas IgG IgA IgM Množství protilátek

5 TECHNIKY SÉROLOGICKÉHO PRŮKAZU DVOJITÁ IMUNODIFÚZE (OUCHTERLONY)
INFEKČNÍCH NEMOCÍ: DVOJITÁ IMUNODIFÚZE (OUCHTERLONY) precipitace v gelu v Petriho miskách do gelu difunduje proti sobě Ag a Ab v bodě ekvivalence vzniká precipitační linie kvalitativní průkaz příklady použití: systémové kandidózy (C. albicans, krusei) aspergilózy (A. flavus, fumigatus, niger, terreus)

6 PRECIPITACE V GELU

7 korpuskulární antigen
AGLUTINACE korpuskulární antigen reakce Ag s Ab se projeví jako viditelný aglutinát důležitá je příprava antigenu: kultivace mikroba, promytí suspenze, nastavení optim. hustoty, inaktivace (teplota, fenol ...) použití: průkaz protilátek identifikace mikroba známým antisérem provedení: mikrotitrační destičky zkumavky kvantitativní stanovení - ředění séra geometrickou řadou titr = převrácená hodnota nejvyššího ředění séra, které ještě dává pozitivní reakci (ředění 1:160 = titr 160) sledování dynamiky titrů !

8 ŘEDĚNÍ SÉRA

9 PŘÍKLAD AGLUTINAČNÍ TECHNIKY V DESTIČCE

10 AGLUTINACE příklady použití aglutinace: Listerióza (L. monocytogenes) (sérotyp O-I, II nebo O-V) hodnocení: titr>160, dynamika (párové vzorky) Tularémie (Francisella tularensis) hodnocení titr>20, dynamika (párové vzorky) Pertuse, parapertuse (Bordetella pertussis, parapertussis) hodnocení: očkování ! (směrodatný je min. 4-násobný vzestup nebo pokles titrů)

11 AGLUTINACE Brucelóza (Brucella abortus) inkompletní (blokující) protilátky - váží se na Ag ale neaglutinují ho Coombsův test (s antiglobulinovým sérem) chronické stadium infekce

12

13 Salmonelózy (Salmonella sp.) - Widalova reakce sérotypy
AGLUTINACE Salmonelózy (Salmonella sp.) - Widalova reakce sérotypy antigeny O – somatické antigeny H – bičíkové Vzhled aglutinátu kompaktní, zrnitý - Ab proti O (somatickým) Ag chomáčkovitý (roztřepatelný) – Ab proti H (bičíkovým) Ag antigen Vi (povrchový, polysacharidový – stnovuje se jinou metodou - hemaglutinací) Kaufmannovo-Whiteovo diagnostické schéma provedení ve zkumavkách hodnocení: titr>80, dynamika

14 AGLUTINACE

15

16 NEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACE
bakteriální Ag je navázán na zvířecích erytrocytech (nosič) polysacharidové Ag se váží přímo proteinové Ag se váží po opracování (tanin, CrCl3) kvantitativní test (titr) příklady použití: Yersinia enterocolitica (O3), Yersinia pseudotuberculosis syfilis (Treponema pallidum, TPHA) Salmonella typhi (Vi Ag)

17 NEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACE

18 PŘÍKLAD VÝSLEDKU HEMAGLUTINAČNÍ TECHNIKY

19 TEST INHIBICE HEMOLÝZY (NEUTRALIZAČNÍ TEST)
ASO (antistreptolysin O, ASLO) infekce Streptococcus pyogenes ( hemolytický streptokok skupiny A) sterilní následky streptokokových nákaz (revmatická horečka, glomerulonefritida) provedení: SLO (streptolysin O) hemolyzuje erytrocyty in vitro, v přítomnosti protilátek dochází k zábraně hemolýzy - test inhibice hemolýzy (neutralizační test) kvantitativní test (Uml) hodnocení: >200, dynamika (párové vzorky) alternativa – stanovení ASO nefelometricky

20 STREPTOLYZIN (ASLO) - inhibice hemolýzy

21 NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE
protilátková odpověď v jednotlivých třídách Ig (IgM, IgG) kvalitativní provedení (základní ředění séra) kvantitativní provedení (titry) příklady použití: borelie syfilis - FTA-ABS

22 NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE

23 ENZYMOVÁ IMUNOSORPČNÍ ANALÝZA (ELISA)
Lze využít jak pro stanovení protilátek (v izotypech IgG, IgM aj.) tak pro stanovení antigenu komplex Ag - Ab detekován sekundární protilátkou značenou enzymem (křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza) komplex Ag – Ab je vázán na imunosorbent, nenavázané Ag (Ab) se odstraní promytím Ag: celobuněčný lyzát (rozbití ultrazvukem, hypotonické prostředí, zmražování - rozmražování), bakteriální exoprodukty, rekombinantní Ag aj. protilátková odpověď v jednotlivých třídách Ig (IgG, IgM) vysoká citlivost (1ng/l) hodnocení testu kvalitativní (hraniční sérum, cut-off) kvantitativní (kalibrační křivka)

24 ENZYMOVÁ IMUNOSORPČNÍ ANALÝZA (ELISA)
příklady použití ELISA technik protilátky proti Helicobacter pylori protilátky proti borelióze (B. burgdorferi, garinii, afzelii) protilátky proti virovým infekcím (herpetické viry, hepatitidy, HIV a mnoho jiných) přímý průkaz Ag (HBsAg, HIV)

25 ELISA – průkaz specifických protilátek

26 ELISA – průkaz antigenu

27 IgM „capture“ – průkaz specifických protilátek IgM
proti infekčnímu agens (odstranění vlivu specifických IgG protilátek)

28 TYPICKÝ VÝSLEDEK STANOVENÍ SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK TECHNIKOU ELISA

29 WESTERN BLOT (IMUNOBLOT)
průkaz přítomnosti protilátek proti jednotlivým Ag (bakteriálním, autoantigenům, ...) krok - elektroforéza proteiny ve směsi se rozdělí podle mol. hmotnosti na polyakrylamidovám gelu v přítomnosti SDS (dodecylsíran sodný – anionický detergent) - udělí proteinům záporný náboj 2. krok - blotování transport proteinů z gelu na nitrocelulózovou membránu v elektrickém poli

30 WESTERN BLOT (IMUNOBLOT)
3. krok - imunodetekce přidání vzorku (sérum pacienta s IgG proti antigenům B. burgdorferi) přidání sekundární protilátky (zvířecí antisérum proti lidskému IgG značené Px) přidání substrátu (v místě vazby specifické protilátky na Ag vzniká barevná reakce) 4. krok - vizuální hodnocení přítomnosti (intenzity) barevné reakce u specifických bakteriálních Ag

31 WESTERN BLOT (IMUNOBLOT)
příklady použití: borelióza (B. burgdorferi) – konfirmace výsledků testu ELISA Helicobacter pylori – sérologický průkaz infekce kmeny s vyšším patogenním potenciálem (CagA antigen) AIDS (HIV) konfirmace ELISA technik

32 WESTERN BLOT (IMUNOBLOT)

33 WESTERN BLOT (IMUNOBLOT)

34 IMUNOBLOTOVÁ ANALÝZA PROTILÁTEK PROTI BORRELIA BURGDORFERI
POZITIVNÍ KONTROLA KLINICKÉ VZORKY IgM IgG

35 SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ SYFILIS
1. vyhledávací (screeningové) testy krevní dárci, dárci orgánů, těhotné, podezření na syfilis 1.1. Rychlá reaginová reakce (RRR, RPR, VDRL) netreponemový test reaginy (Ab proti Ag lipidového charakteru - kardiolipin) nepřímá aglutinace – nosič Ag uhlíkové částice provedení na sklíčku, papírové kartičce, v destičce hodnocení kvalitativní, titry reakce 2-3 týdny od počátku infekce, titry reagují na léčbu

36 SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ SYFILIS
1.2. TPHA treponemový test nepřímá hemaglutinace s antigenem T. pallidum navázaným na zvířecí erytrocyty kvalitativní test (základní ředění 1:80) zůstává pozitivní celý život

37 SÉROLOGICKÝ PRůKAZ SYFILIS
2. Konfirmační testy 2.1.FTA-ABS nepřímá imunofluorescence Ag T. pallidum – Nicholsův kmen nutno předem vysytit séra sorbentem (ABS) sorbent – vysytí protilátky proti nepatogenním treponemám (T. macrodentium, refringens, denticola, orale) hodnocení: titry IgG x IgM (časná infekce, vrozená syfilis)

38 SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ SYFILIS (FTA-ABS)

39 SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ SYFILIS
2.2. ELISA test specifický antigen navázaný na destičku IgG x IgM odpověď 2.3. TPI (imobilizační test) provádí referenční laboratoř Praha suspenze živých treponem + sérum (Ab) + komplement pozitivní výsledek = imobilizace 50% treponem především diagnostika pozdní (neléčené) syfilis