Posttranslační modifikace proteinů v regulaci BC.

Prezentace na téma: "Posttranslační modifikace proteinů v regulaci BC."— Transkript prezentace:

1 Posttranslační modifikace proteinů v regulaci BC

2 Posttranslační modifikace jsou běžnou záležitostí Fosforylace transkripčních faktorů (viz jaderná lokalizace Swi5 z minula) Fosforylace CDK samotných Ale fosforylací možnosti nekončí... vazba dalších podjednotek, ubikvitinace, degradace...

3 Fosforylace proteinů obecně - rekapitulace N C O H C H R N C O H C H R O C CH 2 CH 3 OH CH OH S, Ser T, Thr Y, Tyr O P O- O CH 3 CH CH 3 A, Ala V, Val F, Phe CH 2 C O O- Q, Glu H, His

4 wee mutanti S. pombe wt cdc2-w wee1: tyrosin kináza cdc25: fosfatáza, opačný fenotyp! (P. Nurse et al.) (... mik1!) dvojitý mutant wee1 cdc25??

5 cdc13 (G2 cyklin) Substrátem Wee1 a Cdc25 je CDK! cdc2 Y15 - P cdc13 (G2 cyklin) cdc2 Y15 cdc25 wee1/mik1 nim1

6 CDC25 obvod je evolučně starý (aspoň u opisthokont) Aspergillus: NimT (Nim/Bim terminologie...) S. cerevisiae má... ale fenotyp?? –na první pohled nic –ALE víc dvojjaderných buněk – kontrola kvality (pučení) HeLa: Y15F – předčas. vstup do mitosy!! Xenopus: Y15 P ace nutná pro blok mitosy po aphidicolinu Rostliny???

7 (Simpson and Roger, Curr. Biol. 14:R693, 2005)

8 Exprese kvasinkového Cdc25 v rost. buňkách má fenotyp (Orchard et al.... Suchomelová, Lipavská... 2005)

9 CDC25, Ostreococcus Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value gb|AAQ16122.1| dual specificity phosphatase Cdc25 [Ostreoco... 795 0.0 gb|AAH02287.1| Cdc25b protein [Mus musculus] 112 2e-23 ref|NP_075606.1| cell division cycle 25 homolog B [Mus musc... 112 2e-23 gb|AAH57568.1| Cdc25b protein [Mus musculus] >gi|26335863|d... 112 2e-23 ref|XP_331695.1| hypothetical protein [Neurospora crassa] >... 111 4e-23 ref|NP_598255.1| cell division cycle 25A [Rattus norvegicus... 109 1e-22 ref|NP_598256.1| cell division cycle 25B [Rattus norvegicus... 109 1e-22 gb|AAR26469.1| cell division cycle 25B [Homo sapiens] >gi|1... 109 1e-22 gb|AAB21139.1| p63 [Homo sapiens] 109 1e-22 ref|NP_068658.1| cell division cycle 25B isoform 2 [Homo sa... 109 1e-22 ref|NP_004349.1| cell division cycle 25B isoform 1 [Homo sa... 109 1e-22 gb|AAH09953.1| CDC25B protein [Homo sapiens] >gi|11641413|r... 109 1e-22 ref|NP_997695.1| cell division cycle 25B isoform 5 [Homo sa... 109 1e-22 gb|AAP36368.1| Homo sapiens cell division cycle 25B [synthe... 109 1e-22 emb|CAE45909.2| hypothetical protein [Homo sapiens] 109 1e-22 pdb|1CWR|A Chain A, Human Cdc25b Catalytic Domain Without I... 109 1e-22 dbj|BAB46915.1| hypothetical protein [Macaca fascicularis] 109 1e-22... ref|XP_456705.1| unnamed protein product [Debaryomyces hans... 94 8e-18 ref|XP_446231.1| unnamed protein product [Candida glabrata]... 93 1e-17 emb|CAA45885.1| NIMT/CDC25 [Emericella nidulans] >gi|422216... 92 3e-17

10 „CDC25“, Arabidopsis Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value pdb|1T3K|A Chain A, Nmr Structure Of A Cdc25-Like Dual-Spec... 273 7e-73 gb|AAO39886.1| At5g03455 [Arabidopsis thaliana] >gi|2645085... 271 3e-72 emb|CAB83305.1| putative protein [Arabidopsis thaliana] >gi... 271 3e-72 gb|AAM63780.1| unknown [Arabidopsis thaliana] 268 3e-71 ref|NP_912542.1| Hypothetical protein [Oryza sativa (japoni... 175 2e-43 gb|AAU11500.1| rhodanese-like protein [Holcus lanatus] 170 8e-42 ref|NP_922597.1| unknown protein [Oryza sativa (japonica cu... 169 2e-41 gb|EAA75237.1| hypothetical protein FG05666.1 [Gibberella z... 70 1e-11 gb|EAA53924.1| hypothetical protein MG01909.4 [Magnaporthe... 68 7e-11 ref|XP_502979.1| hypothetical protein [Yarrowia lipolytica]... 67 1e-10 gb|EAA58015.1| hypothetical protein AN6040.2 [Aspergillus n... 66 2e-10 ref|XP_327252.1| predicted protein [Neurospora crassa] >gi|... 62 3e-09 ref|XP_462481.1| unnamed protein product [Debaryomyces hans... 56 3e-07 gb|EAL22654.1| hypothetical protein CNBB1040 [Cryptococcus... 53 2e-06 gb|EAK93619.1| possible protein phosphatase [Candida albica... 52 4e-06 ref|NP_595247.1| rhodanase domain protein [Schizosaccharomy... 51 9e-06 ref|NP_869856.1| hypothetical protein RB11227 [Rhodopirellu... 46 2e-04 gb|EAA42885.1| GLP_574_157368_157730 [Giardia lamblia ATCC... 46 3e-04 ref|YP_144680.1| putative sulfurtransferase [Thermus thermo... 45 4e-04 ref|ZP_00282577.1| COG0607: Rhodanese-related sulfurtransfe... 44 9e-04 sp|P27477|THTR_SYNP7 Putative thiosulfate sulfurtransferase... 44 0.001 gb|EAK87236.1| hypothetical protein UM06379.1 [Ustilago may... 44 0.001 gb|AAP10445.1| Hydroxyacylglutathione hydrolase [Bacillus c... 43 0.003 ref|NP_015526.1| Arr2p [Saccharomyces cerevisiae] >gi|45269... 42 0.003 ref|YP_005018.1| putative sulfurtransferase [Thermus thermo... 42 0.003 ref|XP_448265.1| unnamed protein product [Candida glabrata]... 42 0.003 emb|CAA45885.1| NIMT/CDC25 [Emericella nidulans] >gi|422216... 42 0.006 Landrieu et al. 2004 (chybí regulační doména?)

11 A to ještě není všechno: CDK mají i další fosforylační místa. T14 Y15 T161 Y15 T14 T161 Y15 T14 Y15 T161 T14 Y15 T161 cdc25 wee1 cyklin

12 CAKs – CDK activating kinases Kvasinky: S. pombe: –Mcs6/Mcs2 (CDK/cyklin) je CAK i CTD kin. –upstream CAKAK (monomerní) S. cerevisiae: –monomerní CAK (Cak1p) –monomerní CTD kin (Kin28p)

13 A co rostliny? Arabidopsis: –CAK1-CAK4 –CAK2, CAK4 blízké CDK7 –substrátem CTD i CDK –CAK1 (CDKF): upstream od CAK2,4 (CAKAK!), komplementuje cak1 ts Shimotohno et al. (incl. K. Bišová) 2004

14 CAK mezi rost. CDK Robbens et al. 2004

15 (Doerner lab 2005) exocytosis via NSF (PCTAIRE! – Liu et al. 2006)... a u živočichů

16 Rozdíly jsou v délce kinázové kaskády? CDK CAK CAKAK S. pombe, metazoa, rostliny S. cerevisiae CTD inaktivní aktivní kináza substrát

17 Degradace proteinů jakožto „extrémní modifikace“

18 Zpět k cyklovým hodinám kvasinek

19 Rekapitulace: transkripční regulační obvody pučivé kvasinky Amon et al. 1993 Co brání současné aktivaci CLB a CLN? Swi4, Swi6 Mbp1, Swi6

20 Mutanti S.c. s dlouhými pupeny a G1 jádrem cdc4, cdc34, cdc53

21 ... a také všeobecný nedostatek CLB! (Schwob et al. 1994) (drženo na živu GAL:CLB5)

22 Clb/Cdc28 potřebuje k aktivaci ještě něco...

23 ... co chybí v „dlouhopupenatých“ mutantech. (pozor na kontroly!!)

24 p40 SIC1 : inhibitor CDK nalezen biochemicky esenciální ale dvojitý mutant cdc34 sic1 replikuje v pm- je cdc34, cdc4, cdc53 třeba pro degradaci?? ANO! inhibitory CDK degradace

25 Model

26 Jorgensen and Tyers 2000 Sic1 sám je regulován i transkripčně

27 CycD CLB Inhibitory CDK (CKI): Cdc28 CDK4 CycA etc. CDK2/4 p40 Sic1 p15 p21, p27 Kip1

28 CKI a vstup do cyklu (živ. b.) G0/G1 S pRB CycD/CDK4 CycE/CDK2 p15 p16 p21 p27 p53

29 CDK inhibitory jakožto antionkogeny

30 Co jsou Cdc4, Cdc34, Cdc53?? Degradace proteinů zprostředkovaná ubikvitinací

31 Ubiquitin 76 aa, 8.5 kDa 96 % ident. člověk-kvasinka

32 CDC34 = E2!!!

33 E3 – ubikvitin ligázy: SCF (Skp1/cullin/F-box) Cul1 = cullin = Cdc53!! Sic1 Cdc34 Cdc4 NEDD8= Rub1 (related to ubiquitin)

34 Jiné tváře SCF Cul1 = cullin = Cdc53!!, CUL1 Sic1 Cdc34 Cdc4 TIR1 auxin response fotomorfogeneze Neddylace: AXR1 deNeddylace: COP9 signalosom

35 ... degradace cyklinů...

36 Úloha CDK-cyklinových komplexů: co je třeba pro vstup do mitosy (G2/M)? Aktivace CDK vazbou „mitotických cyklinů“ (CLB, CycA/B), tedy degradace CKI a cyklinů předchozí vlny? Aktivace CDK fosforylací T161 Dereprese CDK defosforylací T14, Y15 Ještě něco??

37 Jakou roli hraje degradace mitotických cyklinů? Nedegradovatelný cyklin A,B Nadprodukce „destruction boxu“ Metaphase arrest!! Je destrukce cyklinu nutná pro přechod Meta/Ana? RxxLxxxxN cyclin „destruction box“

38 cyclin CDK metafáze anafáze telofáze G1 CDK

39 ALE: cdc15! Anafáze při vysoké hladině CLB/CDK!! (Surana et al. 1993) lND fenotyp

40 ... a nadbytek CLB blokuje v anafázi, ne metafázi! (Surana et al. 1993)

41 cyclin CDK metafáze anafáze telofáze G1 CDK Cdc15... ALE předcházející pokusy s M blokem po inhibici degradace cyklinů!

42 Jak smířit modely? cyclin CDK metafáze anafáze telofáze G1 CDK Cdc15 X... a co tedy degraduje ty cykliny??

43 CLB se nehromadí v buňkách bez CLN (Amon et al. 1994)

44 ... a příčinou je specifická degradace!

45 ... a navíc: Obnova CLN kinázy stabilizuje CLB. Model!

46 Mají „cyklové hodiny“ trojtaktní motor? (CKI) CLN CLB none