1937 Karcag, Maďarsko 1950 Izrael

Prezentace na téma: "1937 Karcag, Maďarsko 1950 Izrael"— Transkript prezentace:

1 Ubikvitinový systém pro degradaci proteinů a některé z jeho funkcí při kontrole BC
1937 Karcag, Maďarsko 1950 Izrael Faculty of Medicine at the Technion in Haifa 2004 Nobelova cena za chemii AVRAM HERSHKO

2 University of California, San Francisco
Mechanismus indukce syntésy tyrosin-aminotransferasy (TAT) vlivem steroidních hormonů v kultivovaných jaterních buňkách Degradace TAT ( ) Gordon Tomkins 1939 izotopové značení 15N-Leucin Méně než 1/3 izotopů nalezeno v moči => většina zabudována do proteinů tkání Stálá váha zvířat – dynamická výměna proteinů Degradace abnormálních a poškozených proteinů Rudolf Schönheimer (BRD, )

3 První pokus Výměna média – rychlý pokles Poločas rozpadu 2-3h
Degradace zastavena inhibitory tvorby energie v buňce (KF a další) Potvrzovalo studii Simpsona o spotřebě En. při uvolňování AMK z proteinů v játrech Nepřímý důkaz, En. nutná pro udržení kyselého pH v lysozomu Pohlcení lysozomem ne, degradace TAT vyžaduje specifický enzym Spotřeba ATP ( neobvyklý proces – existence intracelulárního proteolytického systému)

4 Proteolytický systém z lyzovaných retikulocytů závislý na ATP
Hledání příčin potřeby energie v Izraeli Využití klasické biochemie Reakce buněčných lyzátů ve zkumavkách věrohodně reprodukující procesy Frakcionace a oddělování komponent Čištění a charakterizace komponent Rekonstrukce systému z izolovaných přečištěných jednotek Joseph Etlinger Proteolytický systém z lyzovaných retikulocytů závislý na ATP (1977) Alfred Goldberg Proerytroblast → Basofilní erytroblast → Polychromatofilní erytroblast → Ortochromatický erytroblast → Retikulocyt → Erytrocyt

5 Identita APF-1 a ubikvitinu potvrzena 1980 Wilkinsnem
Izolace a charakterizace komponent ATP-dependent proteolytic system from reticulocyt lysates Irvin Rose Rozdělení lyzátu do 2 frakcí na diethylaminoethyl (DEAE-) celulóze Frakce 1 obsahuje látky neadsorbované - hemoglobin (vyčištění) Frakce 2 uvolněná solným roztokem, obsahuje nehemoglobinové proteiny Samostatně frakce nejevily aktivitu, opětovnou kombinací počala ATP-dependentní degradace Aktivní složka ve frakci 1 byla malá, teplotně stabilní molekula Pojmenovaná APF-1 (ATP-dependent Proteolysis Factor 1) Identita APF-1 a ubikvitinu potvrzena 1980 Wilkinsnem Aaron Ciechanover

6 Ubikvitin – funkce a vazba
První izolace Goldsteinem při zkoumání hormonů brzlíku Postupně objeven ve všech tkáních a všech eurkaryotických organismech (ubiqity = všudypřítomný) Funkce neznámá Malá molekula z frakce 1 = domněnka regulační podjednotky neznámého enzymu z frakce 2 Radioaktivně označený ubikvitin byl přidán k frakci 2 za přítomnosti i nepřítomnosti ATP Gelovou chromatografií bylo zjištěno spojení s velkou vysokomolekulární látkou Navázán kovalentní peptidovou vazbou Ubikvitin se váže na velké množství proteinů (SDS-page)

7 Ubikvitin označený 125I byl inkubován s neoznačenými lysozomy a naopak a po rozdělení
Ubikvitin se váže na substrát, který má být rozložen ATP-dependentním proteolitickým systémem (např. lysozomem)

8 Původní předpoklad

9 Jak je ubikvitin navázán na proteiny?
10 let práce, podstata návrhu správně Sled 3 enzymů – E1: ubikvitin aktivující – E2: přepravce ubivitinu – E3: ubikvitin ligasa

10 Funkce enzymů E1 zajistí aktivaci karboxylového konce glycinového zbytku ubikvitinu pomocí ATP a následuje připojení aktivovaného ubikvitinu do thiolového vazebného místa enzymu E1 thioleserovou vazbou Transacylací je aktivovaný ubikvitin přesunut do SH místa enzymu E2, který přenese ubikvitin až k – NH2 skupině cílového proteinu Navázání na protein probíhá pomocí enzymu E3, který je substrátově specifický Velký počet E3 enzymů

11 Proteiny s navázanými řetězci ubikvitinů jsou rozloženy v proteozomovém komplexu (26S)
Ubikvitin je uvolněn ubikvitin-C-terminální hydrolasou nebo isopeptidasou

12 Mechanismus degradace cyklinu B a objeveni APC/C komplexu
1990 Jak je degradace specifických buněčných proteinů obstarávána ubikvitinovým systémem v selektivních a regulovaných dějích? Cyklin B - Pozitivně regulující jednotka Cdc2 (Cdk1) - Komplex Cdk1-cyklin B = MPF, podporuje vstup do mitosy - Inaktivace MPF = degradace cyklinu B, nutné pro opuštění mitosy Jaký je systém degradace cyklinu B a proč pouze na konci mitosy?

13 Spisula solidissima (Surf clam)
Produkce velkého počtu oocytů Luca a Ruderman vytvořili bezbuněčný systém z oplozených oocytů, který reprodukoval specifická stádia BC degradace mitotických cyklinů Pomoc Roberta Palazza, Leonarda Cohen, Joan Ruderman. Joan Ruderman (USA) Frakcionace systému prokázala výskyt dvou komponent důležitých pro navázání ubikvitinu k cyklinu B (E2-C, E3-like activity) E3-like activity: 1500 kDa komplex, který váže ubikvitin na mitotické cykliny, oscilující v BC, inaktivní v interfázi a aktivní na konci mitosy. K aktivitě potřebuje přítomnost MPF (Cdk1-cyclin B).

14 Název ubikvitnové ligasy cyklosom
Podobná zjištění: Kirschner team – Xenopus eggs Anaphase-Promoting Complex Nasmyth team – Yeast Anphase-Promoting Complex / cyclosome = APC/C Degradace mnoha regulátorů BC (securin – inhibitor počátku anafáze) Kontrolní bod dělícího vřeténka (dovoluje rozchod chromatid pouze po řádném připojení na vřeténko)

15 Degradace Cdk inhibitoru p27Kip1
p27 způsobuje zastavení buňky v G1-fázi, zabraňuje vstupu do S (inhibuje Cdk2-cyklin A a Cdk2-cyklin E) p27Kip1 univerzální inhibitor pro všechny cyklin-Cdk komplexy Prokázána degradace p27 ubikvitinovým systémem Michele Pagano Pokusy pro identifikaci ubikvitin-ligasového systému označujícího p27 k degradaci, in vitro na HeLa buňkách p27 se vázal na uvikvitin v extraktu rostoucích buněk více než v buňkách „uzamčených“ v G1 Prokázána nutnost fosforylace p27 na T187, komplexem Cdk2-cyklin E pro ligaci p27-ubikvitin in vitro => kompetentní systém in vitro se stejnými pochody jako in vivo Identifikace enzymu E3 – ubikvitinové ligasy Přepoklad nutné přítomnosti SCF (Skp1-Cullin1-F-box protein) kvůli fosforylaci p27 substrátu

16 SCF komplexy velká rodina ubikvitin-protein ligáz variabilní F-box podjednotka rozpoznává příslušný fosforylovaný proteinový substrát Objev Skp2 proteinu (S-phase kinase-associated protein 2) = specifický F-boxu pro SCF, který připojuje ubikvitin k p27

17 Navázání ubikvitinu na p27
Vyvázání Skp2 protilátkou z extraktu proliferujících buněk = zrušení vazné aktivity p27-ubikvitin Dodaná rekombinantní vyčištěná Skp2 kompletně obnovila navázání ubikvitinu na p27 In vitro důkaz: vazba p27 na Skp2 závisí na fosforylaci p27 na T187 (In vivo popsal Pagano lab) => Skp2 je specifický a limitující faktor SCF komplexu, který předurčuje p27 k degradaci Oscilace Skp2 v BC: v G1 velmi nízký, roste před vstupem do S a dále jen klesá

18 Pokus o sestavení komlexu z jednotlivých komponent (Cullin, Skp1,Skp2, Roc1, Cdk/cyclin E, E1 a E2)
Chyběla Cks1 (cyklin kinase subjunit 1) Patří do konzervativní rodiny proteinů Suc1/Cks, jako jediný z rodiny váže Cdk k fosforylovanému proteinu Pro regulaci BC nezbytná

19 Rodina Suc1/Cks a Cks1 Pouze Cks1 podmiňuje vazbu p27-ubikvitin v uměle poskládaném systému přečištěných komponent Ostatní Suc1/Cks proteiny mají vazebná místa pro Cdk a aniontové vazebné místo Cks1 se dokáže navázat na Skp2 a podporuje spojení Skp2 s fosforylovaným p27 na T187 Cks1 má tři vazebná místa, všechna nutná k asociaci Skp2 na T187-fosforylovaný p27

20 Apeluje na propojení genetiky s biochemií!