Projekt lidského genomu

Prezentace na téma: "Projekt lidského genomu"— Transkript prezentace:

1 Projekt lidského genomu
2010 Marek Vácha Projekt lidského genomu

2 Lidský genom má přibližnou velikost 3,2 Gb
z nichž je 2,95 Gb tvořeno euchromatinem. 28% sekvencí je transkribováno do RNA a z těchto 28% je pouhých 5% přepisováno do proteinů; což je 1,1%- 1,4% absolutní velikosti celého genomu člověka. Přes 50% genomu je tvořeno repetitivními sekvencemi: 45% genomu je tvořeno jedním ze čtyř typů parazitických DNA elementů, 3% genomu tvoří repetice jen několika bází a 5% genomu je tvořeno recentními duplikacemi velkých segmentů DNA. Většina parazitické DNA je tvořena reverzními transkripty z RNA. Lidský genom tak z určitého úhlu pohledu připomíná moře repetitivních sekvencí s malou příměsí genů.

3 Projekt lidského genomu
přírodní vědy dosáhly působivých poznatků ve zkoumání external Universe, vnějšího světa seriózně se mluví o 13 rozměrech a Hubbleův teleskop posílá fotografie i velmi vzdálených míst vesmíru existuje ale doposud neprozkoumaný internal Universe, vesmír v nás, neméně rozsáhlý a neméně překvapivý

4 Projekt lidského genomu
Navržen v 80. letech, oficiální začátek 1990 Navržen postup: Genetická mapa Fyzikální mapa Úplná sekvence genomu člověka

5 Projekt lidského genomu
očekávaná doba trvání byla 15 let očekávaná cena: 3 miliardy dolarů 1981: publikována sekvence DNA lidské mitochondrie ( pb)

6 Pomocné projekty vytvoření nových technologií
zlepšení technik umožňující fyzikální a genetické mapování zlepšení technik sekvenování DNA konstrukce databází sekvenování genomu pěti modelových organismů E.coli, Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster a Mus musculus ELSI: Etické, Legální, Sociální Implikace

7 Personalizovaná medicína
od terapie již rozvinuté choroby snaha k preventivní medicíně, založené na znalosti rizika konkrétního člověka ovšem jen málo chorob je způsobeno nesprávnou funkcí jediného genu, většinou jedná o multifaktoriální choroby

8 Projekt lidského genomu
problémy konstrukce genetické mapy člověka člověka dost dobře nelze křížit jen málokdy můžeme studovat rodokmeny s genetickou chorobou tak dobře, že jsme schopni vytvořit geneticko mapu člověka (VIZ drosophily s černým tělem a zakrnělými křídly)

9 Projekt lidského genomu
do 1970 byla pozornost zaměřena na rozdíly v strukturních genech jenomže asi jen 1,5 % lidské DNA kóduje proteiny a na správnou stavbu těchto proteinů je silný selekční tlak od 70. let se začala zkoumat negenová DNA, která se výrazně liší od jednoho člověka ke druhému …a byla vynalezena metoda zkoumající RFLPs

10 HUGO 1988 vzniká HUGO Human Genome Organization

11 Hierarchický přístup

12 Genetická mapa Metoda je založena na relativních vzdálenostech markerů, které odpovídají frekvencím rekombinace (pravděpodobnosti crossing-overů) Jako marker může sloužit buď gen a jeho fenotypový projev, nebo jakákoli jiná identifikovatelná sekvence, jako jsou RFLPs nebo mikrosatelity Mapování skončilo nalezením cca markerů v celém lidském genomu

13 Fyzikální mapa Se snaží vyjádřit vzdálenost mezi markery v absolutní míře, nejlépe v počtu nukleotidů pro genom člověka byla dokončena cca 1994 DNA celého chromosomu je rozstříhána dvěma restriktázami na identifikovatelné fragmenty, které se překrývají Je užita próba, pomocí které jsou zjišťovány fragmenty, které se překrývají Metoda je zvána procházení chromosomu (chromosome walking)

14 Procházení chromosomů

15 Chromosome walking Prvním klonovacím vektorem pro zisk DNA bude YAC, který obsahuje fragmenty miliony pb dlouhé Nebo BAC, umělý bakteriální chromosom, který může obsahovat fragmenty – pb dlouhé Tyto fragmenty se užívají pro chromosome walking Finální fragmenty jsou dlouhé asi 1000pb – ty se uchovávají v plasmidech nebo virech a již se dají snadno sekvenovat

16 Whole-genome sequencing
1992 J.Craig Venter navrhuje vyhnout se genetickému a fyzikálnímu mapování a rozstříhat DNA celého genomu na krátké fragmenty, které by se potom přímo sekvenovaly 1995 takto sekvenuje Haemophilus influenzae 1998 zakládá Venter společnost Celera Genomics s heslem „Discovery can´t wait“ a stává se rivalem veřejného consortia 2000 ve spolupráci s akademiky publikována sekvence Drosophila melanogaster

17 Whole-genom shotgun approach Celera Genomics

18 Veřejné consortium a Celera

19 Veřejné consortium a Celera

20 Veřejné consortium a Celera Genomics: remíza
V únoru 2001 Celera publikuje v Science sekvenování 90% genomu člověka Ve stejném týdnu publikuje totéž veřejné consortium v časopise Nature Spory: Veřejné consortium vystavuje výsledky sekvenování průběžně veřejně na síti… …a Celera tato data využívá Celera Genomics doufá, že by nalezené geny patentovala – to by znamenalo obrovské zisky díky farmaceutickému průmyslu

21 Veřejné consortium x Celera Genomics Francis Collins Craig Venter

22

23 Poznámka pod čarou v současnosti se Craig Venter věnuje úsilí vytvořit živou buňku z chemikálií pokud se mu to podaří, bude to první živá buňka vytvořená z „neživota“ po 4 miliardách let

24 Rok 2001 Cca 50 organismů je buď zcela nebo téměř sekvenováno
Asi 10 archeí E.coli Saccharomyces cerevisiae C. elegans Arabidopsis thaliana

25 Sekvenování DNA Sangerova metoda
Pro tuto metodu se užívají fragmety DNA o délce 200 – 300pb, ale ne delší a polyakrylamidový gel (agarosový gel má příliš velké póry pro odlišení fragmentů lišící se jedinou bází)

26 Sekvenování DNA Sangerova metoda

27 Sekvenování DNA Sangerova metoda

28 Sekvenování DNA Sangerova metoda
Fred Sanger dostal za tuto metodu druhou Nobelovu cenu (první již měl za objev struktury insulinu)

29 Sekvenování DNA dnes Primer pro každou ze čtyř reakcí je značen odlišnou fluorescenční barvou – každá DNA končící dideoxy bází má jinou barvu – zde A, C, G, T. Na rozdíl od klasické elektroforézy probíhá nyní elektroforéza v kapiláře, a laser „za pochodu“ – tak jak DNA postupuje gelem detekuje jednotlivé barvy

30

31 Sekvenování DNA dnes Protože laser snímá jednotlivé kroužky barevné DNA za pochodu, stačí krátký gel, kterým neustále prochází DNA – laser stále zaznamenává stále delší a delší (= pomalejší a pomalejší) kusy DNA, zatímco kratší jsou již dávno z gelu venku Díky barvám stačí jedna kapilára (v klasické podobě musely být čtyři pruhy v jedné gelové destičce)

32 Sekvenování DNA dnes

33 Galerie genomů

34 Galerie genomů

35 Galerie genomů

36

37

38

39 Počty genů Mycoplasma genitalium (genom pouhých 580 000 pb) – 517 genů
asi jen 265 – 350 genů jsou opravdu potřebné k životu

40 Počty chromosomů jsou u různých organismů velmi různé
mravenec Myrmecia pilosula má pouze 1 pár chromosomů (samec jen jediný chromosom) kapradina Ophioglossum reticulatum 630 párů chromosomů

41 Počty chromosomů u ptáků
nejnižší počet chromosomů: dytík úhorní (Burhinus oedicnemus) 2N = 40 nejvyšší: ledňáček říční (Alcedo atthis) 2N = 132 většina ptáků kolem 80 chromosomů chromosomy u ptáků jsou však velikostně diferencovány na makrochromosomy a mikrochromosomy hustota genů v mikrochromosomech je výrazně vyšší – mikrochromosomy tvoří jen 18 % - 23 % genomu, ale obsahují více než polovinu genů (Gaisler, J., Zima, J., (2007) Zoologie obratlovců. Academia, Praha, str. 450)

42 Lidský genom

43 Lidský genom

44 Lidský genom 41% genomu tvořeno GC páry, 59% jsou AT
Přibližně polovinu genomu tvoří repetice Geny tvoří cca čtvrtinu genomu, jen asi 1,5% ale kóduje proteiny, rRNA a tRNA, zbytek jsou introny

45 Lidský genom Geny tvoří cca čtvrtinu genomu, jen asi 1,5% ale kóduje proteiny, rRNA a tRNA, zbytek jsou introny u bakterií 90 % genomu kóduje proteiny, 10 % jsou regulační oblasti Caenorhabditis má 27 % genomu obsazeno geny kódující proteiny Drosophila 13 %

46 srovnání distribuce genů ve náhodně zvolené oblasti o velikosti pb u různých organismů. Pro srovnání je uvedeno i pb lidského chromosomu 21. Introny jsou naznačeny tence, šipky ukazují směr transkripce.

47 Repetitivní DNA u různých organismů
u bahníků a ocasatých obojživelníků je obsah repetitivní DNA až 50 % – 90 %! u ptáků je obsah repetitivní DNA 15 % % u savců je obsah repetitivní DNA 30 % %

48 Lidský genom Stovky genů člověka vykazují bakteriální původ a do lidského genomu se dostaly zřejmě někdy v různých fázích evoluce obratlovců horizontálním transferem. Několik desítek genů zřejmě pochází z transpozabilních elementů Ačkoli je přibližně polovina genomu člověka tvořena transpozabilními elementy, zdá se, že v hominidní linii tyto elementy pozvolna ztrácely na aktivitě. V genomu člověka se zdá že jsou již všechny zcela neaktivní

49 Dispersed repeats (Jobling, M. A. , et al
Dispersed repeats (Jobling, M.A., et al. (2004) Human Evolutionary Genetics. New York, Garland Science Třída Počet kopií v haploidním genomu Frakce genomu Délka LINEs 21% 6 000 – pb SINEs 13% 100 – 300 pb Retrovirus-like elements 8% 6 000 – pb Kopie DNA transpozonů 3% 2 000 – pb

50 Vyložení pojmů mezi repetitivní sekvence se řadí transposony
u člověka již neaktivní cut-and-paste mechanismus přes DNA intermediát retrotransposony u člověka ještě občas aktivní copy-and-paste mechanismus přes RNA intermediát

51 Lidský genom zatím nebyl podán důkaz, že by transposony u člověka byly aktivní transposony se v genomu pohybují mechanismem cut-and-paste

52 Lidský genom Alu elementy se nachází v oblastech bohatých na GC. Zdá se, že tyto elementy, donedávna považované za zcela „sobecké“ mohou prospívat svým lidským hostitelům. Alu elementy se přepisují do RNA a jejich počet vzrůstá během virové infekce Mutace probíhají při meiose u mužů přibližně dvakrát častěji než u žen.

53 Genom jádra a mitochondrií u člověka

54 Vyložení pojmů mezi repetitivní sekvence se řadí transposony
u člověka již neaktivní cut-and-paste mechanismus přes DNA intermediát retrotransposony u člověka ještě občas aktivní copy-and-paste mechanismus přes RNA intermediát

55 Lidský genom zatím nebyl podán důkaz, že by transposony u člověka byly aktivní transposony se v genomu pohybují mechanismem cut-and-paste

56 Lidský genom Alu elementy se nachází v oblastech bohatých na GC. Zdá se, že tyto elementy, donedávna považované za zcela „sobecké“ mohou prospívat svým lidským hostitelům. Alu elementy se přepisují do RNA a jejich počet vzrůstá během virové infekce Mutace probíhají při meiose u mužů přibližně dvakrát častěji než u žen.

57 Lidský genom Rekombinační frekvence jsou až dvojnásobné v distálních oblastech chromosomů než je průměr a obecně jsou častější v kratších raméncích, v četnosti přibližně jeden crossing-over na každém raménku každého chromosomu v průběhu meiosy. bylo identifikováno více než 1,4 milionů SNPs. Tento nález má velkou důležitost pro srovnání genomů lidí z různých oblastí světa.

58 LINE = long interspersed nuclear elements (LINEs)
LINE patří mezi retrotransposony a šíří se technikou copy-and-paste u člověka existují tři rodiny LINE elementů, zvány LINE1, LINE2 a LINE3 tyto tři rodiny tvoří dohromady 20 % genomu člověka! nacházejí se obvykle v euchromatinu a obvykle v místech bohatých na AT

59 LINE - 1 jediný LINE1 je ještě v genomu aktivní a sám LINE1 tvoří 17 % genomu člověka LINE-1 má přibližně pb, opakuje se v genomu – x LINE1 kóduje dva proteiny RNA binding protein protein, který má zároveň aktivitu endonukleázy a reverzní transkriptázy endonukleáza štěpí dvoušroubovici lidské DNA obvykle na místě TTTT↓A během integrace se reverzní transkriptáze ovšem jen velmi zřídka zdaří přepsat celý LINE element

60 LINE - 1 většina přepsaných LINE elementů má délku kolem 900 pb a jsou tedy zkrácené a nefunkční jen asi každá stá inzerce má plnou délku 6,1 kb z asi LINE1 sekvencí v genomu plné délky je jen asi 60 – 100 schopno transpozice a občas mohou způsobit nemoc inzercí do funkčního genu LINE1 mašinerie je ale odpovědná za většinu reverzních transpozicí v genomu tato mašinerie rovněž poněkud oslabuje striktní platnost základního dogmatu

61 LINE 1 celkový mechanismus ještě není zcela znám

62 Alu elementy patří mezi SINE
délka kolem 300 pb, v genomu člověka jich je asi milión! tvoří až 13 % sekvence celého genomu! na každých 100 narozených dětí se objeví jedna nová Alu sekvence alu sekvence jsou tedy velmi silným endogenním mutagenem u člověka …což je velmi špatná zpráva zatímco LINE elementy mají rády oblasti chudé na geny (a odpovídají jen za 0,07 % spontánních mutací u člověka), Alu elementy jsou hojnější v oblastech bohatších na geny

63 Lidský genom

64 Lidský genom

65 Lidský genom

66 Lidský genom

67 Lidský genom

68 Lidský genom

69 Lidský genom

70 Přepisování genů u člověka
800 genů je house-keeping genes tyto se přepisují v každé buňce lidského těla každá buňka lidského těla přepisuje celkem asi genů

71 Velikost chromosomů člověka Odhadovaný počet genů
Chromosomy 9, 10, 11 a chromosomy 21 a 22 nejsou řazeny podle velikosti – číslování chromosomů proběhlo podle mikroskopu, kde se velikosti špatně odhadují

72 Nejmenší autosom u člověka je 21
chromosom 21 obsahuje asi jen 225 genů

73 Lidský genom obsahuje překvapivě málo genů
Množství nekódující DNA v lidském genomu je repetitivní DNA, ale lidské geny obsahují také neobvykle dlouhé introny (lidské introny jsou cca 10x delší než introny Drosophily nebo Caenorhabditis) U lidských genů častější alternativní sestřih – typický gen dává vznik dvěma až třem polypeptidům… …takže počet druhů proteinů v buňce je odhadován na Ještě je třeba připočíst četné posttranslační úpravy

74 Genové pouště asi 25 % genomu člověka tvoří oblasti, které jsou větší než pb a které jsou zcela bez genů …a jsou proto nazývány gene deserts

75 Chromosom Y přes 90 % chromosomu Y nepodléhá rekombinaci
důležitá je zejména pseudoautosomální oblast 1 (PAR 1), dlouhá 2,6 Mb

76 GC oblasti geny leží spíše v oblastech bohatých na GC

77 Rekordy a zajímavosti gen pro dystrofin má 2,7 Mb, z nichž je ovšem 99,4 % intronů! exony tvoří jen pb SRY gen na chromosomu Y nemá žádné introny (má jen jeden exon 612 pb) jaderný genom obsahuje pb mitochondriální DNA – 25x víc, než obsahují mtDNA samotné mitochondrie! lidská mitochondrie obsahuje pb DNA

78 u 40 % lidských genů se předpokládá alternativní sestřih

79 Velikost genomu a počet genů různých organismů

80 Paradox hodnoty C C = množství DNA organismus
Fritillaria assyriaca má genom Mb u obojživelníků se velikosti genomů pohybují mezi 700 – Mb genom pšenice ( Mb) je 11x větší než genom rýže (430 Mb), ačkoliv obě obiloviny mají podobnou morfologii, podobný počet biochemických drah a fyziologických procesů paradox hodnoty C = neúměra mezi složitostí organismu a velikostí genomu

81 Poučení ze sekvenování různých genomů Bacteria and Archea
genomes are „compact“ genomes are correllated to metabolic diversity Mycoplasma genitalium – žije uvnitř eukaryotických buněk velikost genomu bp., 517 genů Streptomyces coelicolor – půdní bakterie s velmi komplikovanými metabolickými drahami velikost genomu 8,7 mil. bp., genes

82 Poučení ze sekvenování různých genomů Bacteria and Archea
large genetic diversity between species cca 15 % - 30 % of genes are unique to a species! lateral gene transfer Thermatoga maritima – žije v horkých pramenech až 80 st. Celsia spolu s mnohými Archei až 25 % jejích genů je velmi blízce příbuzných genům Archeí! přenosy jsou způsobované viry, plasmidy a transpozony

83 Poučení ze sekvenování různých genomů Bacteria and Archea
virulence genes among patogenic bacterias often arise by lateral gene transfer

84 Poučení ze sekvenování různých genomů Eucarya
genes are generally orders of magnitude larger exons are only few percent of the genome majority of the genome are „repeated sequences“

85 Lidský genom obsahuje překvapivě málo genů
Proteom = soubor proteinů v buňce Lidské proteiny mají rovněž víc domén než proteiny bezobratlých snad až u 40 % genů se předpokládá alternativní sestřih

86 Studium a srovnávání genů
Asi třetiny genů u E.coli byl pro vědce zcela nová Srovnání genomů ukázalo silné evoluční vztahy mezi i vzdálenými organismy a důležitost jednodušších organismů pro pochopení složitějších Na drosofily je nahlíženo jako na „malé lidičky s křídly“ Gen pro lidskou nemoc může být objeven srovnáním analogického genu u kvasinek

87 Studium a srovnávání genů
The chimpanzee genome is 98.77% identical to the human genome. On average, a typical human protein-coding gene differs from its chimpanzee ortholog by only two amino acid substitutions; nearly one third of human genes have exactly the same protein translation as their chimpanzee orthologs. A major difference between the two genomes is human chromosome 2, which is the product of a fusion between chimpanzee chromosomes 12 and 13.

88 Studium exprese genů Zkoumá se, které geny jsou zapínány v kterých situacích V určitých zájmových buňkách je isolována mRNA a vytvoří se cDNA Tato DNA se srovnává s jinými známými DNA a zkoumá se, které geny se v dané buňce přepisovaly Takto se zjistí, které geny jsou zapnut v různých fázích ontologického vývoje, v různých tkáních, nebo ve zdravých či nemocných orgánech

89 DNA mikročipy DNA array je také zvána DNA chip
díky podobnosti s pčítačovými čipy

90 DNA micročipy V ideálním případě jsou na jednom čipu přítomny všechny geny daného organismu Vzorky z různých tkání mohou být označeny různými barvami, a tak na jednom čipu vidíme aktivitu genů z různých tkání Užívá se při srovnání nádorové a nenádorové tkáně porozumění tomu, jak jednotlivé geny spolupracují v konkrétní tkáni

91 Zkoumání funkce genů In vitro mutageneze: in vitro (ve zkumavce) je daný gen mutován, pak vrácen do buněk raného embrya a zkoumá se, jaký bude mít nefunkční gen fenotypový efekt RNA interference (RNAi) – užívá se syntetická dsRNA (=dvojřetězcová), jejíž sekvence odpovídá sekvenci genu. Tato RNAi nějak zničí příslušnou mRNA. RNAi ale existují i přirozeně v buňce a slouží jako obrana proti virům a retrotranspozonům

92 Nové pohledy RNA ovšem vzniká nejen přepisováním genů, nýbrž i přepisováním junk DNA! Některé tyto RNA se překládají do proteinů, jiné nikoli k čemu tyto RNA vlastně jsou, je záhada v každém případě junk DNA téměř jistě není natolik „junk“, jak se myslilo

93 Další výhledy Proteomika = zkoumání proteomu (=souboru proteinů v buňce) Mnohem obtížnější než genomika – proteiny mají různou strukturu a různé chemické vlastnosti, nacházejí se v různých koncentracích v různých fázích života buňky či tkáně Bioinformatika – spojení genetiky s informatikou a matematikou

94 Metoda 454

95 Studium evoluce člověka
Lidé t.č. žijící na planetě pochází z Afriky z populace žijící před – lety Dva cizí lidé mají shodu v 99,9% pb Většina rozdílů je způsobena tzv. SNPs (=Single Nucleotide Polymorphisms) – rozdíl v jediné bázi

96 Studium evoluce člověka
U člověka je SNP přítomna jedna na nukleotidů – v genomu člověka jich je asi Vztah mezi RFLP a SNP: některé RFLP jsou SNP. Ale mnoho SNPs nejsou RFLPs protože se nenachází v restrikčních místech a musí být objeveny přímým sekvenováním DNA. Mnohé RFLPs jsou způsobeny změnou více než jedné báze

97 Praktické aplikace Identifikace genů, jejichž mutace způsobují nemoci člověka Geny ale ovlivňují i řadu „negenetických“ chorob, jako je revmatismus nebo AIDS Díky DNA mikročipům možno provádět srovnání mezi genovou expresí zdravé a nemocné tkáně Díky PCR umíme detekovat i malé množství DNA viru HIV v krvi Genetické testování u osob,které jsou nyní ještě zcela zdravé (např. Huntingtonova nemoc)

98 Praktické aplikace I když ještě gen nemáme naklonován, můžeme zjistit přítomnost abnormální alely, pokud jsou v její blízkosti RFLPs. Je malá pravděpodobnost, že crossing over proběhne mezi markerem a genem – budou se tedy dědit společně

99 Genová terapie Pokud by se zdařilo zasáhnout kmenové buňky, mohla by se do nich vložit správná alela např. pomocí virového vektoru Navzdory zprávám z denního tisku, zatím existuje jen teoreticky

100 Člověk: Možní kandidáti na genovou terapii
nemoci, které jsou způsobené defektem v jediném genu: ADA deficiency, cystická fibrosa, hemophilia, familiální hypercholesterolemie, alpha-1 antitrypsin deficience nemoci, které vznikají nesprávnou interakcí několika genů: diabetes, hypertenze

101 Neterapeutické genetické modifikace etické problémy
Co vlastně odlišuje závažné onemocnění od „lehčího“ onemocnění a od genetické variace? Mělo by se adolescentovi, jehož rodiče oba měří 150 cm aplikovat růstový hormon? pokud bude jednoho dne objeven gen, řekněme, posilující paměť, měl by se aplikovat genový transfer na požádání?

102 Neterapeutické genetické modifikace etické problémy
Může být tentýž přístup aplikován ke genetické modifikaci lidských parametrů, které nesouvisí přímo s nemocí? Genetickou složku mají určitě lidské znaky, jako je: tělesná výška barva kůže inteligence

103 Neterapeutické genetické modifikace etické problémy
82% prezidentů zvolených v USA v 20. století bylo vyšší postavy než protikandidáti U dvou mužů v USA vykonávající stejnou profesi se každých 2,5 cm tělesné výšky nad průměr (172 cm) odráží v o 600 $ vyšším ročním příjmu

104 Neterapeutické genetické modifikace etické problémy
vědecká, teologická i metafyzická tradice západu chápe nemoc jako zlo, proti kterému je třeba bojovat odstranění utrpení, které je způsobeno nemocemi, se obecně chápe jako morální dobro či dokonce jako morální imperativ ovšem medicínské znalosti jsou již dnes používány ke zlepšení řady rysů člověka, které nemají s nemocí nic společného – typickým případem je plastická chirurgie… …která ovšem není chápána jako neetická či neakceptovatelná

105 Neterapeutické genetické modifikace etické problémy
Nebezpečí vzniku novodobé eugeniky Dítě má právo být kompletním překvapením pro rodiče Determinace k budoucnosti: ztráta nejzákladnější svobody Možnost vzniku novodobé aristokracie („lepších“ oproti „normálním“) Vztah geny – chování: je moje úspěšná maturita docílena mou pílí nebo úsilím genetiků?

106 2009: The Complete Genomics
The Complete Genomics of Mountain View, California said it would sell whole human genomes in 2009 for $5,000 the company revealed a human genome it said it had sequenced using nine machines for eight days over Christmas. (2008/2009) the technology is highly accurate, with less than one-third of a per cent chance of making an error in any given base.

107 2009: The Complete Genomics
the company says by June 2009 its materials cost will be down to $1,000 per genome. The company aims to launch commercially that month (February 2009), sequence 1,000 genomes this year and 20,000 human genomes next year.

108 2007: tři lidé 2008: počet lidí s sekvenovaným genomem je stále menší než počet lidí co chodili po Měsíci 2009: cena je dolarů 2015: odhadovaná cena dolarů a doba sekvenování odhadovaná na dny

109 Forenzní využití DNA technologií (=v soudnictví)
Dříve se dala určit jen krevní skupiny, a to musel být vzorek relativně čerstvý Dnes díky PCR stačí nepatrné množství krve nebo spermatu Díky RFLP se DNA každého člověka odlišuje (s výjimkou jednovaječných dvojčat) a pomocí Southernova blottingu jsme schopni určit podobnosti a rozdíly vzorku a konkrétního člověka Stačí asi 1000 buněk

110 DNA fingerprint Srovnává se krev oběti, neznámá krev a krev potenciálního útočníka Pravděpodobnost, že dva lidé budou mít náhodou stejný vzorec RFLP je mizivá Obžalovaný Krev z oblečení obžalovaného Krev oběti

111 Paternitní spory Kauza (časopis Týden) 3. ledna 2005
Německé ministryně proti testům V německých rodinách žijí statisíce dětí, které jsou plodem sexuální aféry manželky. Podle odhadů expertů je každé desáté dítě "kukaččí". Pochybující muži to ale mají už nějakou dobu relativně snadné. Do příslušné laboratoře stačí poslat na kousku vaty vzorky slin svých a svého (údajného) dítěte; nejpozději do pěti dnů odesilatel s jistotou na 99,9 procenta ví, zda je potomek, o kterého se stará či na něho platí výživné, opravdu jeho. Když nejsou k dispozici sliny, stačí jiný genetický materiál, třeba vlasy, použitá náplast, vyplivnutá žvýkačka nebo exkrementy z plenek. Potřebnou sadu s vatovými tyčinkami a trubičkami na vzorky lze dostat bez receptu v každé lékárně. Absolutně diskrétní servis na určení otcovství nabízí jen ve Spolkové republice zhruba třicet laboratoří za poplatek 200 až 400 eur (přibližně 6200 až korun, tedy o něco méně než v ČR). Obchod s nejistotou jenom kvete. Podle odhadů německého ministerstva zdravotnictví se v roce 2004 uskutečnilo patnáct až dvacet tisíc testů.

112 Místo RFLP se stále více užívají mikrosatelity
Mikrosatelitní DNA = repetice cca 2-10 pb opakované 10 – 100x Různé osoby se liší v počtu repetic Např. konkrétní osoba má na jednom místě 118 repeticí ACA, na jiném 65 atd. atd. Takovýto polymorfismus je zván STR (=Simple Tandem Repeats) Restrikční fragmenty se liší velikostí, nikoli nutně počtem restrikčních míst

113 DNA fingerprint Užívá se 5 oblastí genomu člověka, kde je známa mimořádně velká variabilita mezi jedinci Pro PCR stačí 20 buněk Pravděpodobnost, že dvě osoby budou mít stejný vzorec fragmentů je 1: Důkaz pomocí DNA má – podle mnohých – větší váhu než očité svědectví…

114 Personální genomika Projekt HGP stál tři miliardy dolarů
v roce 2007/8 by sekvenování genomu zájemce mělo stát dolarů Do deseti let (2016) by sekvenování genomu nemělo stát víc než plochá televize …čímž zřejmě nastanou „orgie sebediagnóz“ za pomocí domácích PC.

115 Environmentální využití
Upravené bakterie dokáží metabolizovat kovy (měď, olovo, nikl) a měnit je v sulfáty, které se pak snadno isolují Těžba těchto kovů (v budoucnosti) Čištění toxických odpadů po těžbě Degradace doposud nerozložitelných jedovatých chemikálií v přírodě Metabolizace ropných skvrn

116 Využití ve farmaceutickém průmyslu
Proteiny ve velkých množstvích dnes vyrábí bakterie nebo kvasinky Především insulin a lidský růstový hormon (STH)

117 Farmakogenomika cytochrom P450 hraje důležitou roli v oxidativní degradaci cizích molekul, mezi které patří i řada léčiv. cytochrom P450 je ve skutečnosti celá rodina blízce příbuzných enzymů, jejichž substrátem jsou cizorodé molekuly, před kterými tyto enzymy organismus chrání. Například isoenzym CYP2D6 likviduje zejména léčiva s antidepresivními účinky. Tento isoenzym má řadu alelických variant, z nichž některé jsou méně účinné a jiné naopak vykazují vysokou aktivitu. Tyto alely se vyskytují v různých frekvencích v různých lidských populacích. Pacienti, kteří mají alely kódující méně aktivní formy tohoto enzymu, jsou mnohem citlivější na žádoucí účinek drogy, avšak více se u nich rovněž projeví nežádoucí vedlejší účinky léku (Clark 2005). Vzniká tak nové vědní odvětví zvané farmakogenomika, která se snaží vytvořit léky přesně uzpůsobené genetické konstituci pacienta. Nejprve je zjištěna pacientova genetická konstituce a potom je adekvátně aplikováno léčivo.

118 Použití v „živočišné výrobě“
Transgenní organismy = obsahují v sobě geny dvou druhů organismů Ovce s lepší vlnou, prasata s libovějším masem, krávy co rostou rychleji Např. tak, že gen krávy , důležitý pro růst svalů je isolován a přenesen do jiného plemena krávy nebo dokonce ovce Transgenní ovce mají v mléce proteiny důležité pro člověka (hormony apod.)

119 Transgenní myš V roce 1982 Ralph Brinster a Richard Palmiter vytvořili „transgenní“ myši – do myších embryí byl vložen krysí gen pro růstový hormon. Myš, nesoucí tento cizí gen (na obr. vlevo) produkovala velké množství růstového hormonu a vyrostla do dvojnásobné velikosti ve srovnání se svými sourozenci (vpravo) Brinster, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania

120 Transgenní organismy Isoluje se oocyt a in vitro se provede oplodnění spermií Z cizího organismu se naklonuje žádaný gen Tento gen se injikuje do zygoty Musí se provést velké množství pokusů, ale někdy se cizorodý gen začlení do genomu zygoty Zygota se implantuje do dělohy náhradní matky

121 Genetické inženýrství u rostlin
Rostliny odolné chorobám, nebo se zpomaleným zráním Díky tomu, že jsou prakticky všechny buňky totipotentní (=buňka je schopna dát vznik nové rostlině) se s rostlinami pracuje lépe než s živočichy Jako vektor se užívá Ti plasmid z Agrobacterium tumefaciens V přírodě tento plasmid způsobuje tumory rostlin Pracuje se s Ti plasmidem, upraveným tak, že tumory nezpůsobuje

122 Genetické inženýrství u rostlin
Žádaný gen se vloží do Ti plasmidu Plasmid se vloží do bakterie, která pak infikuje rostlinu, nebo se plasmid přímo injikuje do rostlinných buněk

123 Genetické inženýrství u rostlin
Velkou nevýhodou Ti plasmidu je, že Agrobacterium napadá pouze dvouděložné Přibližně polovina sklizně kukuřice a sóji v USA jsou GMO (geneticky modifikované organismy) Mnoho transgenních rostlin obsahuje gen pro resistenci k herbicidům Rostliny upravené k odolnosti vůči škůdcům snižují užívání chemických insekticidů Snaha vytvořit rostliny schopné fixovat vzdušný dusík (=náhrada dusíkatých hnojiv)

124 Transgenní rýže „Normální“ rýže
„Zlatá“ rýže. Tato transgenní rýže obsahuje beta-karoten, který je zdrojem vitamínu A. Tato rýže pomáhá odstranit nedostatek vitamínu A u poloviny světové populace – která je závislá na rýži jako hlavní potravině. V současnosti trpí 70% dětí stáří do pěti let v jihovýchodní Asii nedostatkem vitamínu A. Jako vektor byl užit Ti plasmid.

125 Případná nebezpečí Transgenní rostliny by mohly cizí geny (např. odolnosti proti pesticidům) nějak předat divokým plevelům – nebezpečí vzniku „superplevele“ Vzniká technologie pro vytvoření „geneticky modifikovaného člověka“

126 S díky za pozornost Orko