SDS-PAGE (= sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) - metoda pro separaci proteinů dle velikosti (molekulové hmotnosti)

Prezentace na téma: "SDS-PAGE (= sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) - metoda pro separaci proteinů dle velikosti (molekulové hmotnosti)"— Transkript prezentace:

1 SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ II Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

2 SDS-PAGE (= sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) - metoda pro separaci proteinů dle velikosti (molekulové hmotnosti)

3 Pracovní postup příprava polyakrylamidových gelů
smíchání lyzátů z tkání se vzorkovým pufrem povaření vzorků při 95C po dobu 4 min. nanesení vzorků na gel vlastní elektroforéza při konstantním napětí barvení proteinů v gelu pomocí Coomassie Blue odbarvení gelu nalezení aktinu a myosinu ve vzorcích tkání, porovnání exprese proteinů mezi jednotlivými tkáněmi chemiluminiscenční detekce aktinu

4 Separace proteinů v polyakrylamidovém gelu
--- Myosin (těžký řetězec) --- Aktin --- Tropomyosin --- Myosin (lehký řetězec) --- Myosin (lehký řetězec) --- Myosin (lehký řetězec) 1. Marker Aktin 2. Játra Myosin 3. Srdce Marker 4. Sval

5 Složení vzorkového pufru pro SDS-PAGE
Tris pufr utváří vhodné pH SDS (dodecyl sulfát sodný) je detergent poskytující proteinům negativní náboj glycerol díky vyšší hustotě zajišťuje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení bromofenolová modř je barvivo umožňující sledovat průběh elektroforézy (pohyb čela v gelu)

6 Úrovně organizace proteinů
• Primární struktura = pořadí aminokyselin v polypeptidovém řetězci • Sekundární struktura = prostorové uspořádání hlavního řetězce části proteinu, např. α-helix a β-list • Terciární struktura = trojrozměrné uspořádání celého peptidového řetězce, udržované disulfidickými vazbami, elektrostatickými a hydrofóbními interakcemi • Kvartérní struktura = uspořádání podjednotek v proteinu

7 Příprava vzorku pro SDS-PAGE
proteiny je nutné před separací denaturovat obvykle působením SDS a tepla (zahřátí na cca 95°C)  zachována je tak POUZE primární struktura proteinů

8 Příprava vzorku pro SDS-PAGE
denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj na jednotku délky proteinu daný vazbou SDS  rychlost migrace v gelu tedy závisí pouze na jejich molekulové hmotnosti

9 _ + Jak funguje SDS-PAGE?
Negativně nabité proteiny se pohybují ke kladné elektrodě (anoda) Menší proteiny se pohybují rychleji Proteiny se rozdělují podle velikosti (molekulové hmotnosti) _ +

10 Proč používat k separaci proteinů polyakrylamidový gel?
polyakrylamidový gel: pevná a inertní matrix ideální pro separaci proteinů menší velikost pórů než u agarosy proteiny jsou výrazně menší než chromozómy a běžně separované fragmenty DNA vytvořen polymerací akrylamidu a N´,N´-methylenbisakrylamidu zahájenou volnými radikály vzniklými při rozkladu persíranu amonného (ammonium persulfate = APS).

11 100 bp fragment DNA – cca 65 kDa
Molekulová hmotnost (velikost) proteinů měřena v daltonech (Da) či kilodaltonech (kDa), 1 kDa = 1000 Da Dalton = jednotka atomové hmotnosti = 1 Da se přibližně rovná hmotnosti atomu vodíku (1,66 x g) průměrný nukleotidový pár = 649 Da průměrná aminokyselina = 110 Da 200 AA protein – cca 20 kDa vs. 100 bp fragment DNA – cca 65 kDa

12 Hlavní proteinové složení svalů
Protein kDa Function titin center myosin in sarcomere dystrophin anchoring to plasma membrane filamin cross-link filaments into gel myosin heavy chain 210 slide filaments spectrin attach filaments to plasma membrane nebulin regulate actin assembly a-actinin bundle filaments gelosin fragment filaments fimbrin bundle filaments actin form filaments tropomyosin 35 strengthen filaments myosin light chain 27 slide filaments troponin (T, I, C) 30, 19, 17 mediate regulation of contraction thymosin 5 sequester actin monomers

13 Separace proteinů v polyakrylamidovém gelu
--- Myosin (těžký řetězec) --- Aktin --- Tropomyosin --- Myosin (lehký řetězec) --- Myosin (lehký řetězec) --- Myosin (lehký řetězec) 1. Marker Aktin 2. Játra Myosin 3. Srdce Marker 4. Sval

14 Western blot analýza (imunochemická detekce proteinů)
přenos proteinů separovaných pomocí SDS-PAGE z gelu na membránu identifikace proteinu pomocí imunodetekce, tj. pomocí vazby primární a sekundární protilátky vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence název vznikl jako slovní hříčka dle metody SOUTHERN blot (technika detekce DNA) zavedené Edwardem Southernem analogicky byl vytvořen také název pro metodu NORTHERN blot (technika detekce RNA)

15 Chemiluminiscenční detekce aktinu
stejný objem vzorku z různých izolací MW aktin+myosin srdce sval játra srdce srdce srdce 30 ug proteinu

16 Western blot – příklady klinických aplikací
detekce protilátek (např. potvrzení diagnózy) infekční borelióza, EBV, HIV, HSV, Helicobacter pylori autoprotilátky: antinukleární protilátky (ANA), protilátky proti neuronálním antigenům, profil autoimunitních chorob jater

17 Klinické aplikace - princip detekce
Na proužky membrány byly po elektroforéze metodou WB „nablotované“ příslušné antigeny. Pozice proteinu (antigenu) odpovídá jeho molekulární hmotnosti. Jestliže je vzorek séra pacienta pozitivní, naváží se specifické protilátky ze séra na odpovídající antigen na membráně. Navázané protilátky reagují s anti-humánními protilátkami značenými alkalickou fosfatázou (AP).

18 Klinické aplikace - princip detekce
Navázané protilátky jsou následně inkubovány s roztokem obsahujícím chromogenní substrát, což umožní barevnou reakci. V případě, že vzorek séra obsahuje specifické protilátky, objeví se v pozici odpovídající příslušnému antigenu tmavý proužek. Vyhodnocení proužků (přítomnost/nepřítomnost) na membráně nám určí zda je vzorek pozitivní/negativní (pacient nemocný/zdravý).

19 EUROLINE ANA-Profile 3 EUROLINE-WB: detection of antibodies against Borrelia Line immunoassay for confirmation and discrimination of antibodies HIV-1 and HIV-2

20