AUTOPROTILÁTKY V DIAGNOSTICE AUTOIMUNITNÍCH IMUNOPATOLOGICKÝCH

Prezentace na téma: "AUTOPROTILÁTKY V DIAGNOSTICE AUTOIMUNITNÍCH IMUNOPATOLOGICKÝCH"— Transkript prezentace:

1 AUTOPROTILÁTKY V DIAGNOSTICE AUTOIMUNITNÍCH IMUNOPATOLOGICKÝCH ONEMOCNĚNÍ

2 AUTOIMUNITNÍ IMUNOPATOLOGICKÉ NEMOCI:
* důsledek narušení autotolerance * poškozující zánět * orgánově specifické * orgánově nespecifické (systémové)

3 AUTOPROTILÁTKY: * přítomnost autoprotilátek může být příčinou nebo důsledkem autoimunitní imunopat. reaktivity * přítomnost autoprotilátek je obvykle asociována s imunopatologickým procesem * intenzita poškozujícího zánětu obvykle koreluje s množstvím autoprotilátek * namířené proti imunodominantním epitopům * častým cílem jsou multimolekulové komplexy přítomné v buňce

4 CAVE * existují zdravé osoby s nálezem autoprotilátek * existují pacienti s manifestní imunopatol. nemocí, u kterých nelze očekávanou autoprotilátku detegovat * přítomnost nízkých koncentrací autoprotilátek zvláště třídy IgM může být asociována s infekčním procesem * potřeba molekulově definovaných detekčních systémů (imunoblot, ELISA)

5 LABORATORNÍ PRŮKAZ PROTILÁTEK:
založen na imunochemické detekci metodami: * imunofluorescenční mikroskopické techniky * ELISA * imunoblotové/imunodotové techniky * aglutinace, precipitace * multiplexové metody, biočipy průkaz autoprotilátek: * kvalitativní * kvantitativní: * titr * arbitrární jednotky * koncentrace

6 IMUNOFLUORESCENČNÍ PRŮKAZ PROTILÁTEK:
Užívá se k detekci autoprotilátek reagujících s antigeny přítomnými v tkáních nebo lokalizovaných nitrobuněčně Jako substrát slouží: * orgánové řezy (orgánově-specifické protilátky) * buněčné suspenze: * Hep-2 buněčná linie (ANF) * lidské granulocyty (ANCA)

7 NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE
Sch

8 ELISA – průkaz specifických protilátek

9 BLOTOVÉ TECHNIKY  Imuno-blot  Imuno-dot
Slouží k přesnému průkazu specifičnosti protilátek a k analýze antigenních směsí. Jsou v podstatě kombinací elektroforézy a imunodetekce, založené na sendvičovém principu: konjugát - antilidská protilátka označená enzymem nebo radionuklidem umožňuje vizualizovat místo reakce lidské protilátky s antigenem.  Imuno-blot  Imuno-dot

10 ANTINUKLEÁRNÍCH AUTOPROTILÁTEK - POSTUP
IMUNOBLOTOVÁ ANALÝZA ANTINUKLEÁRNÍCH AUTOPROTILÁTEK - POSTUP Sch

11 HODNOCENÍ Sch

12 IMUNODOTOVÁ ANALÝZA (např. autoprotilátek)
Sch

13 Např. využití „ b i o č i p ů „
PERSPEKTIVY Trend-miniaturizace Např. využití „ b i o č i p ů „ BIOČIP nosič, kde na malé ploše (mm2) je umístěno několik desítek až stovek antigenů. Biočip je inkubován se sérem a navázané protilátky vizualizovány pomocí barevné sondy. Výsledkem je matice barevných bodů, které jsou detekovány optickým systémem a data jsou analyzována s pomocí výpočetní techniky (mikrobiologie, autoprotilátky)

14 IMUNOFLUORESCENČNÍ PRŮKAZ ANTINUKLEÁRNÍCH FAKTORŮ:
ANTINUKLEÁRNÍ FAKTORY: * jsou autoprotilátky reagující s jaderným aparátem buňky * typicky přítomné u nemocných se systémovým onemocněním pojiva * jejich množství souvisí s aktivitou poškozujícího zánětu * mohou pronikat do buňky in vivo * modulují biologickou aktivitu nitrobuněčných molekul

15 ENA: extrahovatelné nukleární antigeny

16 ANTINUKLEÁRNÍ AUTOPROTILÁTKY U VYBRANÝCH ONEMOCNĚNÍ
smíšené

17 ANTINUKLEÁRNÍ AUTOPROTILÁTKY U VYBRANÝCH ONEMOCNĚNÍ

18 NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE K PRŮKAZU ANTINUKLEÁRNÍCH FAKTORŮ

19 HOMOGENNÍ JADERNÁ PLAZMA
difúzní fluorescence zahrnující celou jadernou plazmu antigen: DNA, histony klinická asociace: systémový lupus erythematodes, lékový lupus, revmatoidní artritida, systémová skleróza

20 PŘESNÉ URČENÍ REAKTIVITY ANTINUKLEÁRNÍCH FAKTORŮ
* je možné v případě dostupnosti molekulově definovaných antigenů * molekulové terče pro antinukleární faktory jsou produkovány biotechnologicky * k průkazu slouží: * testy ELISA * imunoblotové techniky

21 METODY ANALÝZY imunoblot ELISA rekombinantní nebo purifikované antigeny

22 ANCA PROTILÁTKY * protilátky proti antigenům cytoplazmy neutrofilů
(ANCA= antineutrophil cytoplasma antigens) * substrátem jsou etanolem nebo formalínem fixované lidské granulocyty * přítomny u nemocných s některými typy vaskulitid

23 * cytoplazmatická granula obsahují funkčně rozdílné makromolekuly
IMUNOFLURESCENČNÍ PRŮKAZ AUTOPROTILÁTEK REAGUJÍCÍCH S CYTOPLAZMATICKÝMI GRANULAMI NEUTROFILNÍCH GRANULOCYTŮ * cytoplazmatická granula obsahují funkčně rozdílné makromolekuly * granulární proteiny se uplatňují v O2 nezávislém mechanismu usmrcování mikroorganismů * obsah cytoplazmatických granulí může být v průběhu zánětu uvolněn mimo buňku * uvolněné granulární proteiny stimulují imunitní odpověď

24 AUTOPROTILÁTKY ANCA A VASKULITIDY

25 cANCA Fluoreskuje celá cytoplazma, mnohdy jsou dobře rozlišitelná
jednotlivá granula v podobě zrnité fluorescence. Jádro nesvítí. antigen: proteináza 3 přítomná v primárních granulích klinická asociace: protilátky jsou hlavním laboratorním markerem pro Wegenerovu granulomatózu. Mohou být přítomny u některých pacientů s mikroskopickou polyangiitidou, nekrotizující glomerulonefritidou nebo s Churg-Straussové syndromem

26 V KONTEXTU KLINICKÉHO STAVU LABORATORNÍCH UKAZATELŮ
ZÁSADA: NÁLEZ AUTOPROTILÁTEK JE NUTNÉ HODNOTIT V KONTEXTU KLINICKÉHO STAVU A VÝSLEDKŮ STANOVENÍ JINÝCH LABORATORNÍCH UKAZATELŮ