Ostatní metody získávání molekulárních dat

Prezentace na téma: "Ostatní metody získávání molekulárních dat"— Transkript prezentace:

1 Ostatní metody získávání molekulárních dat
Pokud bychom měli k dispozici kompletní genomové sekvence organismů, které chceme studovat, žádné takové metody bychom nepotřebovali. Jenže je nemáme a jejich sekvenování je stále pro větší množství vzorků neprakticky drahé. Následující metody umožňují rychle a často levně získat dostatečné množství dat pro otázky, které v molekulární taxonomii řešíme.

2 DNA-DNA hybridizace Stanovit střední teplotu tání homoduplexů
Tm= (TmA + TmB)/2 Stanovit teplotu tání heteroduplexu -Tms Vypočítat pokles ΔTm ∆Tm=Tm - Tms Vypočítat p (podíl rozdílných nukleotidů) p = ΔTm . 0,01 (0,015) Používá se snad jen v bakterální systematice, za hranici druhu je považován pokles Tm o 30% (~ 5% rozdílu nukleotidů)

3 DNA-DNA hybridizace Výhody Multilokusová (totilokusová) metoda
Nevýhody Distanční metoda Experimentálně dosti náročná Vyžaduje větší množství DNA Náchylná k artefaktům (repetitivní DNA) Experimentální náročnost N x N

4 ORGI (overall genome relatedness indices)
Snaha najít jednoduchou míru podobnosti porovnáním celých genomů (v budoucnu nahradí DNA hybridizaci) V současnosti osekvenováno více než bakteriálních genomů ANI (average nucleotide identity) – průměrná identita všech homologních úseků rozpoznaných pomocí BLASTN (Goris a kol. 2007) – hranice bakteriálního druhu 95-96%. Frekvence 4 nukleotidových „slov“ (Richter a Rosseló-Móra 2009) GBDP – průměrná genetická vzdálenost vypočtená z celkového alignmentu dvou genomů (Meier-Kolthoff a kol. 2013) – hranice bakteriálního druhu 0,258. MUMi – podíl oblastí s dokonalou shodou na celkové délce porovnávaných genomů (Deloger a kol. 2009).

5 ORGI (overall genome relatedness indices)

6 IZOENZYMOVÁ ANALÝZA Isozymy – enzymy vykazující stejnou nebo podobnou aktivitu. Alozymy – podmnožina isozymů, alelické formy téhož enzymu (v jednom lokusu) Zymodem -taxonomická jednotka vymezená na podkladě isozymového vzoru

7 IZOENZYMOVÁ ANALÝZA

8 IZOENZYMOVÁ ANALÝZA Princip
Detekce elektroforetickou mobilitou se lišících forem enzymů kódovaných různými alelami určitého genu. Jednotlivé enzymy se detekují prostřednictvím jejich specifické aktivity, většinou pomocí spřažené enzymatické reakce s barevným produktem.

9 RESTRIKČNÍ ANALÝZY Izolace DNA
Nastříhání DNA pomocí restrikčních endonukleáz Velké množství endonukleáz, možno použít i jejich kombinace Problémy s přílišnou komplexitou vzorů Snížení komplexity výchozí DNA Kvalita separace fragmentů Detekce jen určitých zón EcoRI

10 RESTRIKČNÍ ANALÝZY RFLP bakteriální DNA
Komplexita bakteriálního genomu je nízká, a proto vzniká i méně komplexní vzor, ze kterého je možno odečíst jednotlivé pruhy Celková DNA po naštěpení rozdělena na PAGE a obarvena EtBr

11 RESTRIKČNÍ ANALÝZY RFLP organelové DNA
Izolovaná cpDNA naštěpena enzymy, rozdělena na agarose a obarvena EtBr.

12 RESTRIKČNÍ ANALÝZY mtRFLP – krok 1
Celková DNA rozštěpena, rozdělena na agarose, obarvena EtBr

13 RESTRIKČNÍ ANALÝZY mtRFLP – krok 2 – Southern blot

14 RESTRIKČNÍ ANALÝZY mtRFLP – krok 2
DNA z agarosy přeblotována na nylon, hybridizována s mtDNA sondou a detekována autoradiograficky.

15 RESTRIKČNÍ ANALÝZY VNTR – Variable Number of Tantem Repeats
Využívá polymorfismus v počtu kopií tandemových repetic – minisatelitů (10-60 nt). Tento polymorfismus je velmi variabilní i mezi jedinci téhož druhu. Celkovou DNA naštípeme restrikční endonukleázou, která neštěpí uvnitř minisatelitu. Naštípanou DNA přeblotujeme na membránu a hybridizujeme se značenou próbou proti minisatelitu, pokud chceme zviditelnit všechny lokusy (obrázek vpravo), nebo proti minisatelitu a unikátní sekvenci v sousedství, pokud chceme zviditelnit jen jeden lokus (obrázek dole).

16 RESTRIKČNÍ ANALÝZY Výhody Relativní jednoduchost a láce
Velké množství dat Slušná reprodukovatelnost Multilokusový charakter Selekční neutralita znaků U některých variant kodominance znaků

17 RESTRIKČNÍ ANALÝZY Nevýhody Potřeba většího množství DNA
Potřeba kvalitnější a čistší DNA Spíše pro příbuzné druhy Někdy špatně čitelné elektroforetogramy – nutnost snižovat komplexitu DNA Znaky nemusí být nezávislé Spíše distanční metoda

18 Mikrosatelity Mikrosatelity - (nazývané i STR - Short Tandem Repeat) jsou krátké sekvenční motivy (dinukleotidy až hexanukleotidy) vyskytující se na některých místech genomu v mnoha tandemově uspořádaných kopiích o celkové délce až 150 jednotek repetice. Průměrně 1x za 1000 generací dochází k mutacím, při kterých se mikrosatelit prodlouží nebo zkrátí obvykle o jednu jednotku repetice. Proto existuje velmi značný vnitropopulační polymorfismus v délce alel a tento polymorfismus můžeme snadno studovat PCR amplifikací daného lokusu.

19 Mikrosatelity

20 Mikrosatelity Postup při analýze
najít vhodný lokus (genomová knihovna a hybridizace nebo vyhledávání v genomových datech) připravit PCR primery ohraničující daný lokus amplifikovat lokus elekroforéza amplifikovaných fragmentů

21 Mikrosatelity

22 Mikrosatelity

23 Mikrosatelity Využití metody vnitrodruhové studie či příbuzné druhy
kodominance znaků – populační genetika modernější a přesnější varianta alozymové analýzy možno analyzovat velké množství vzorků nákladné pouze zavedení metody pro nové organismy

24 RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
Amplifikace pomocí „náhodných“ primerů Různé metody zvyšování počtu znaků Kombinace primerů, restrikce enzymy, semiselektivní primery (transposomy)

25 RAPD Výhody Cena Rychlost Univerzálnost Malé množství materiálu
Nižší požadavky na kvalitu DNA Obrovské (libovolné) množství dat

26 RAPD Nevýhody Neprodukuje věrohodné znaky (mnoho falešných homologií), při analýze je třeba převést na genetické vzdálenosti Použitelné jen u relativně příbuzných druhů Chybí kodominance Interference znaků Vliv kontaminující DNA Nízká reprodukovatelnost PCR

27 AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

28 AFLP kapilárová elektroforéza standard molekulární váhy
amplifikované fragmenty

29 AFLP Výhody Vysoká reprodukovatelnost výsledků Velké množství znaků
Kodominance znaků? Minimum falešných homologií Lze použít znakově orientované metody Nevýhody Nákladnost kitů i přístrojového vybavení Složitost metody Spíše pro příbuzné druhy

30 PŘESTÁVKA

31 Protein mass fingerprint
Sauer a Kliem 2010, Nature reviews microbiology Nomura 2015, BBA

32 Protein mass fingerprint

33 DNA/RNA mass fingerprint
Sauer a Kliem 2010

34 VYUžití repetitivní DNA
Repetitivní DNA se vyskytuje na mnoha pozicích v genomu. Poloha těchto DNA elementů se liší i mezi jedinci téhož druhu.

35 VYUžití repetitivní DNA
Varianty RAPD používající jeden nebo oba primery nasedající na konzervativní LTR repetici na koncích LTR retrotranspozonů a polymerace směřuje směrem ven z retrotranspozónu. Zvyšuje se tak reproducibilita metody. IRAP – jeden primer nasedající na LTR REMAP – druhý primer nasedá na mikrosatelity R-RAP – druhý primer je náhodný jako u RAPD

36 SINE Short INterspersed repetitive Elements
Retroposony derivované z tRNA, případně 7 SL RNA (Alu). Velikost: PB. Vytvářejí značnou část eukaryotického genomu, často až 104 kopií na genom. Výhodou pro molekulární fylogenetiku je skutečnost, že existuje jen malá pravděpodobnost, že by se u dvou nepříbuzných organismů vložily do stejného místa a je téměř vyloučeno, že by se bezestopy z daného místa vystřihly.

37 ZNAKY a jejich formy x1, y1, z1 = plesiomofie
x2 = synapomorfie (homologie) pro BCD y2 = autapomorfie pro B z2 = homoplázie (konvergence) pro ED

38 SINE Postup Najít nový SINE element: vyhledávání v genomových datech, náhodné sekvenování genomu, skríning genomové knihovny sondou proti SINE. Vytipovat SINE lokusy které jsou polymorfní u studovaného taxonu. PCR amplifikace vybraného lokusu. Ověření přítomnosti nebo absence SINE sekvenací nebo hybridizací se sondami

39 SINE PCR produkty EtBr Hybridizace se SINE probou
Hybridizace s okolní unikátní sekvencí

40 SINE Nikaido a kol. 1999

41 SINE Chen a kol. 2011

42 SINE Nesouhlas přítomnosti SINE s fylogenezí druhů může poukazovat na „incomplete lineage sorting“ – mezi dvěma blízkými speciačními událostmi nedošlo k vytřídění polymorfismu v populaci. Abdel-Halim Salem a kol PNAS

43 SINE Výhody a nevýhody použitelná pro vyšší taxony (maximálně však milionů let málo znaků – není možno počítat délku větví unikátní události - synapomorfie, a proto lze data velmi snadno interpretovat Umožňuje polarizovat fylogenezi – víme, že původní stav je nepřítomnost SINE

44 Single Nucleotide Polymorphism
SNPs Single Nucleotide Polymorphism Polymorfimus DNA, kdy se jedinci nebo druhy liší v jedné nukleotidové záměně AAGCCTA AAGCTTA V tomto případě mluvíme o alelách C a T. Téměž všechny SNPy mají jen 2 alely. Genom dvou lidí se liší zhruba v 3 mil. bazí (ne všechno jsou SNP).

45 SNPs

46 SNPs

47 SNPs genotypizace Hybridizační metody Hybridizační metody
Enzymatické metody Metody založené na fyzikálních vlastnostech DNA Hybridizační metody Molecular beacon

48 SNPs – hybridizační metody
lidských SNPs

49 SNPs – enzymatické metody
Primer extension – např. Infinium (Illumina)

50 SNP – OSTATNÍ METODY Single-Strand Conformation Polymorphism PCR
denaturace renaturace vertikální elektroforéza + + + _ _ _ vizualizace

51 Srovnání metod Metoda DNA hybri dizace Mass fingerptinting Mikro
satelity RFLF (VNTR) SINE RAPD AFLP SNP Počet lokusů Všechny Mnoho Jeden Jeden / mnoho Repliko vatelnost Různá Vysoká vysoká Povaha znaků Distance Kodominantní Kodomi nantní Kodomi nantní Vzácná událost Domi nantní Kodominantní? Kodo minantní Rozlišení Střední vysoké Vysoké Nízké Jedno duchost provedení Těžké duché - Doba trvání Krátká Dlouhá