Luminiscenční spektroskopie

Prezentace na téma: "Luminiscenční spektroskopie"— Transkript prezentace:

1 Luminiscenční spektroskopie
hn k k k k k3 A ® A* ® A* ® A+ ® A+ ® A k k3 k4 A hn hn

2 Luminiscenční spektroskopie

3 Luminiscenční spektroskopie
Fluorescenční spektroskopie Fosforescenční spektroskopie Chemiluminiscenční spektroskopie

4 Základní pojmy Excitace a emise Interakce s rozpouštědlem
Singletový excitovaný stav Singletový základní stav

5 Základní pojmy Stockesův posun – ztráty energie po dobu excitovaného stavu Dl F Absorpce Emise nm

6 Základní pojmy l3 l2 l1

7 Základní pojmy Excitovaný stav – střední doba života 10-7 – 10-9 s. O

8 Základní pojmy Kvantový výtěžek fluorescence
= počet kvant emitovaných/počet kvant absorbovaných = ke/(ke + S kk) ke = rychlost emise kk = rychlost konverzních procesů Intenzita fluorescence látky = f (e, F, N)

9 Základní pojmy Doba života excitovaného stavu
Doba potřebná k poklesu fluorescence na hodnotu 1/e Io Střední doba života t = 1/ kf If = I0 e – t/ t n- refrakční index rozpouštědla e – molární abs. Koeficient n – vlnočet abs. maxima Přirozená doba života to Definovaná pro F = 1 ∞ t0 = 2, n2.nA2 . ∫ e(n)dn A n

10 Základní pojmy F = t/t0 Střední doba života fluorescence
Fluorescein 4,6 ns Chininsulfát 15 – 40 ns NADH 0,5 ns

11 Biochemicky významné fluorofory

12 Instrumentace

13 Instrumentace Zdroj: Xenonová lampa Rtuťová výbojka Laser
Světelné diody - LED (430, 450, 505, 592, 612 and 637 nm)

14 Instrumentace Monochromátor mřížka filtry

15 Instrumentace

16 Instrumentace RF-5301PC – spektrofluorimetr Shimadzu

17 Instrumentace Měření střední doby života fluorescence

18 Podmínky fluorescence
Pokles polarity 6 – 1. Závislost na polaritě a viskozitě Nitrobenzoxadiazol

19 Podmínky fluorescence

20 Podmínky fluorescence

21 Podmínky fluorescence

22 Podmínky fluorescence

23 Podmínky fluorescence

24 Podmínky fluorescence

25 Podmínky fluorescence
Závislost fluorescence na teplotě F 80 40 °C

26 Podmínky fluorescence
Stabilita fluorescenčního signálu chininsulfátu F 80 40 min

27 Podmínky fluorescence
450 nm 1 Rayleighův rozptyl (Tyndalův rozptyl) 2 Fluorescenční emise 3 Ramanův rozptyl Excitace 450 nm 600 nm 1 3 2 3 Emisní spektrum

28 Kvantitativní fluorimetrie
Závislost intenzity fluorescence na koncentraci látky F = f (I, e, c, F) F = Io F [1 – 10-ecd] jestliže c ® 0 F = Io F.2,3.ed.c F c

29 Kvantitativní fluorimetrie
Stanovení koncentrace aminokyselin 390/464 nm 340/455 nm 450/550 nm

30 Kvantitativní fluorimetrie
Stanovení bílkovin CBCQA

31 Kvantitativní fluorimetrie
Detekce bílkovin v gelu (barevně: Coomasie blue, stříbrné barvení) Fluorimetricky: SYPRO Orange (Molecular probes) – citlivost 1 – 2 ng

32 Kvantitativní fluorimetrie
Detekce nukleových kyselin Ethidium bromid rRNA 16 a 23s barvená SYBR Green II Molecular Probes

33 Fluorogenní substráty
Galaktosidasy 4-methylumbelliferyl-a-galaktosid Fluorescein-digalaktosid

34 Fluorogenní substráty
Peroxidasy – amplex red, vznik resorufinu

35 Fluorogenní substráty
Proteinasy, peptidasy Fluorescenční konjugáty proteinů a peptidů

36 Fluorogenní substráty
Fosfolipasa A

37 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Přirozené fluorofory (Tyr, Try) – fluorescence závislá na polaritě prostředí obklopující fluorofor F H2O H2O Emisní spektrum nm

38 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
substrát F310 t (min)

39 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Fluorescenční konjugáty OG Karboxyfluorescein – (494/520 nm) CF Absorpce/emise fluoresceinu při pH 9 CF-karboxyfluorescein OG oregon green Oregon Green - (496/524 nm)

40 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Fluorescenční konjugáty Teramethylrhodamin – 545/580 nm) Kumariny – 350/450 nm)

41 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Fluorescenční konjugáty Dansyl Benzoxadiazol –N-sukcinimid

42 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Fluorescenční konjugáty

43 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
L + M  LM Kd = Lf.Mf/LM Interakce makromolekul s ligandy F Ligand vázaný Ligand volný koncentrace makromolekuly

44 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Ff, Fb – fluorescence volné, vázané frakce Fb, Ff –kvant. Výtěžek fluorescence vázaného, volného ligandu Cb,Cf – koncentrace vázaného, volného Ligandu C – celková koncentrace ligandu F – celková fluorescence F = Ff + Fb F = Cf .Ff + Cb. Fb F = (C-Cb) Ff + Cb. Fb F = CFf – CbFf + Cb. Fb F = Fo + Cb (Fb – Ff) Cb = (F – Fo)/ (Fb – Ff)

45 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Interakce makromolekul s ligandy Použití fluorescenčních analogů Kys. cis-parinarová Fluorescein-PE Anthroyloxypalmitát

46 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Použití značené makromolekuly Fluorescence značené bílkoviny F Koncentrace ligandu

47 Fluorescenční rezonanční transfer energie (Försterův přenos)
Nezářivý přenos energie z donoru na akceptor (1 – 10 nm)

48 Fluorescenční rezonanční transfer energie
DONOR F A F nm

49 Fluorescenční rezonanční transfer energie
DONOR AKCEPTOR F A F nm

50 Fluorescenční rezonanční transfer energie
DONOR AKCEPTOR F A F nm

51 Fluorescenční rezonanční transfer energie
Donor Fo F h = 1 – F/Fo A F nm

52 Fluorescenční rezonanční transfer energie
t – doba života exc. stavu J – překryvový integrál n – refraktivní index rozpuštědla n – vlnočet emise donoru = Ro6/(Ro6 + R6) Ro6 = , t.J/n2no2

53 Fluorescenční rezonanční transfer energie
Použití – změření vzdálenosti mezi dvěma molekulami v bílkovině Tryptofan (290/340) vs. NADH (340/450 nm)

54 Fluorescenční rezonanční transfer energie

55 Fluorescenční anizotropie

56 Fluorescenční anizotropie
Polarizační filtry

57 Fluorescenční anizotropie

58 Fluorescenční anizotropie

59 Fluorescenční anizotropie
Fluorescenční anizotropie r = Iv – Ih I I = Iv + 2Ih Rotační relaxační čas t, střední doba života fluorescence r, rotační relaxační čas molekuly ro – anizotropie nepohyblivé molekuly ro/r = 1 + 3t/r excitace a V objem h viskozita r = Vh/RT ro = (3 cos2a -1)/5 ro/r = 1 + 3tRT/Vh

60 Fluorescenční anizotropie
Využití: Interakce makromolekuly s ligandem F r mg makromolekuly

61 Fluorescenční anizotropie
Využití: Měření viskozity prostředí ro/r = 1 + 3tRT/Vh ro/r = 1 + K/h h = 2,4r/(0,362 – r) r Fl. anizotropie DPHT Vázaného v liposomech DPPC °C

62 Fosforescence Multiplicita M = 2S + 1 hn k1 k4 k5 k4 k3
A ® A* ® A* ® A+ ® A+ ® A k k3 k4 A hn hn

63 Fosforescence Střední doba života t – 100 s

64 Fosforescence Kvantový výtěžek fosforescence fluorescence
FP = k3/(k3 + k2 + k4) Ff = k2/(k3 + k2 + k4) Ff/ FP = k2/k3 fluorescence F fosforescence °K hn k k k k k3 A ® A* ® A* ® A+ ® A+ ® A k k3 k4 A hn hn

65 Fosforescence Experimentální uspořádání

66 Fosforescence Vzorek Rozpouštědla rigidní skla bez krystalů
(ethanol, metanol, voda:ethylenglykol., atd N2

67 Fosforescence Aplikace fosforescence

68 Fosforescence Fosforescence alkalické fosfatasy
3 Try, pouze Try 109 fosforeskuje 1 – nativní enzym 2 – enzym po odstranění Zn 1 2

69 Princip fluorescenční konfokální mikroskopie

70 Chemiluminiscence Luminol

71 Chemiluminiscence Luciferin

72 Chemiluminiscence Aequorin – Aequoria victoria

73 Chemiluminiscence Aequorin – Aequoria victoria

74 Chemiluminiscence Aequorin – Aequoria victoria
Průnik vápníku do mitochondrií Aktivuje oxidaci