Mikrobiologický ústav uvádí

Prezentace na téma: "Mikrobiologický ústav uvádí"— Transkript prezentace:

1 Mikrobiologický ústav uvádí
NA STOPĚ PACHATELE Díl sedmý A: 1) Nepřímý průkaz mikrůbů 2) Přímý i nepřímý průkaz virů L Autor prezentace: Ondřej Zahradníček (kontakt: K praktickému cvičení pro Bi7170c

2 Hlavní obsah Úvod do serologie, precipitace a aglutinace
Dynamika titru, KFR a neutralizace Reakce se značenými složkami Diagnostika virů I Diagnostika virů II

3 ÚVOD PRECIPITACE AGLUTINACE

4 Obsah této části prezentace
Úvod – pohádka Antigen a protilátka Interpretace průkazů protilátek Geometrická řada a a počítání titrů Aglutinace a precipitace: přehled Aglutinace – příklady reakcí Precipitace – příklady reakcí Kontrolní otázky

5 Pohádka Bylo jednou jedno malé dítě, a tomu maminka koupila hračku, aby se naučilo poznávat tvary. Hračka byla plastová destička s dírami různých tvarů, a k tomu tvary, co patřily do těch děr. Jednou dítě řvalo, protože mu cosi nešlo. Maminka přiběhla: „Ale, dítě, nemůžeš rvát čtvereček do díry pro kolečko!“ Podívej, kolečko patří sem, čtvereček tam.

6 Jenže o pár dní později…
…přišla maminka k dítěti do pokoje, a viděla, že se dítěti podařilo narvat kolečko do díry pro šestiúhelníček. I uvědomila si maminka, že pravidla sice platí, ovšem existují z nich občas i výjimky I v přírodě přece platí – pokud má určitý tvar svůj protitvar, stane se občas, že se dá dohromady i dvojice, která k sobě původně neměla patřit.

7 Poučení z naší pohádky Mikroby (ale i třeba rostliny a živočichové) mají na povrchu svých buněk antigeny. Když se setkají s naším tělem, začne naše tělo tvořit protilátky, které jsou vůči těmto antigenům specifické. Specifičnost má ovšem své meze. Někdy existuje zkřížená reaktivita, kdy protilátka reaguje i s antigenem, který je jen podobný tomu, který vyvolal její tvorbu Někdy se také tvoří protilátka proti určité látce, která není součástí mikroba, ale při infekci se uvolňuje například ze stěny cév. Nicméně většinou prokazujeme protilátky proti určitému mikrobu.

8 Antigen a protilátka

9 Antigen a protilátka Antigen = makromolekula pocházející z cizího organismu: rostliny, mikroba, jiného živočicha. (Anebo sice z organismu vlastního, ale v tom případě je na povrchu buněk přestárlých či vadných.) V mikrobiologii nás zajímají mikrobiální antigeny = části nebo produkty* mikrobiálního těla, které vzbuzují v hostiteli antigenní odpověď Protilátka = imunoglobulin, tvořený v těle hostitele (člověka, ale také zvířete) jako odpověď na antigenní výzvu *například toxiny bakterií

10 Metody lékařské mikrobiologie a jejich interpretace
Přímé metody: detekce mikroba, jeho části nebo produktu. Příklady: Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, průkaz antigenu. Pozitivita = je jisté, že agens je NYNÍ přítomno. Nepřímé metody: detekce protilátek proti mikrobovi. Pozitivita = mikrob potkal hostitele v minulosti (nevíme, zda před týdny / měsíci / roky)

11 Dva způsoby, jak využít interakci mezi antigenem a protilátkou:
Průkaz antigenu: laboratorní protilátky (zvířecího původu či ze speciální buněčné linie) + vzorek pacienta nebo kmen mikroba. Přímá metoda Průkaz protilátky: laboratorní antigen (mikrobiální) + sérum (výjimečně sliny, likvor) pacienta Nepřímá metoda

12 Ještě máme dva podtypy průkazu antigenu:
Přímý průkaz antigenu ve vzorku: pracujeme s celým vzorkem a hledáme antigen. Příklad: pracujeme s mozkomíšním mokem a hledáme v něm typické původce zánětů mozkových blan (resp. jejich antigeny) Antigenní analýza: ze vzorku jsme už izolovali kmen a zkoumáme jeho antigen(y). Příklad: máme již vypěstovaný kmen meningokoka a chceme vědět, ke které seroskupině (B či C) patří. (Zpravidla se používá uvnitř bakteriálního druhu.)

13 Interpretace průkazů protilátek

14 Interpretace Průkaz antigenu je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v těle pacienta Průkaz protilátek: je to nepřímá metoda. Nicméně jsou způsoby, jak alespoň odhadnout, kdy přibližně se mikrob s tělem pacienta setkal: Množství protilátek (relativní – titr) a jeho změny v čase (dynamika titru – viz J07) Třída protilátek: IgM/IgG (více v J08) (Avidita protilátek)

15 Jak interpretovat nepřímý průkaz
Akutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM, případně IgM i IgG Pacient po prodělané infekci: malé množství protilátek, pouze IgG (imunologická paměť) Chronická infekce: různé možnosti podle aktivity infekce, mikrobiálního druhu apod. 1 2 1 2

16 Jak provést reakci „kvantitativně“
Je velmi těžké zjistit koncentraci protilátek proti konkrétnímu antigenu (ne tedy celkové množství imunoglobulinů) v.jednotkách mol/l, mg/l apod. Ale dá se dělat jiná věc: mnohonásobně ředit pacientovo sérum. Reaguje-li i po mnohonásobném ředění   v séru je velké množství protilátky Reaguje jen při nevelkém zředění séra   v séru je jen malé množství protilátky

17 Geometrická řada a počítání titrů

18 Geometrická řada Technicky nejjednodušší způsob, jak ředit sérum pacienta, je použití geometrické řady s koeficientem dva. Vycházíme z neředěného séra, nebo ze séra o určitém předředění (např. 1 : 5, 1.:.10, 1 : 50 nebo podobně) V každém případě platí, že v každém dalším důlku je dvojnásobné ředění oproti předchozímu, například tedy řada 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80, 1 : 160…

19 Počítání ředění v serologii
Pozor, v serologii např. ředění 1 : 4 znamená jeden díl séra a tři díly fyziologického roztoku (tj. čtyři díly celkem)! Při „biochemickém“ počítání (počet dílů séra ku počtu dílů diluentu) bychom naše geometrické řady museli značit např. 1 : 9, 1 : 19, 1 : 39, 1 : 79 (namísto 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80). To by bylo značně nepraktické.

20 Geometrická řada: jak ji udělat a) bez předředění původního séra

21 b) s předředěním původního séra (zde například 1 : 100)
Samozřejmě, předředění nemusí být zrovna 1 : 100, může to být třeba 1 : 5, 1 : 10, 1 : 20 či jakékoli jiné.

22 Příprava geometrické řady
Předpokládejme pro jednoduchost, že vycházíme z neředěného vzorku séra V první zkumavce smícháme se stejným objemem diluentu (fyziologický roztok),  ředění 1 : 2 Polovina směsi z ředění 1 : 2 je přemístěna do další zkumavky a smíchána s opět stejným množstvím diluentu  1 : 4 Jedna polovina z 1 : 4 ……  1 : 8 Atd., atd.

23 Titr Po naředění séra pacienta přidáme antigen
V závislosti na konkrétním typu reakce buď přímo vidíme výsledek reakce (aglutinát, precipitát), nebo ho musíme znázornit přidáním dalších složek (např. komplementu, červených krvinek apod. V každém případě lze nakonec nějak odlišit pozitivní a negativní výsledky reakce Nejvyšší ředění, kde ještě vidíme pozitivní reakci, se nazývá titr.

24 Určení titru Titr – nejvyšší ředění, kde je pozitivní reakce. Máme-li dvě řady, je titrem nejvyšší ředění z obou řad dohromady.

25 Ne vždy potřebujeme titry!
Titry nikdy neurčujeme, pokud jde o průkaz antigenu Někdy ale neurčujeme titry, přestože půjde o průkaz protilátek: jde totiž o screeningové reakce Příklad: Každá těhotná žena se vyšetřuje, nemá-li náhodou syfilis. První testy jsou screeningové a provádějí se jen jako kvalitativní. Všechny pozitivní nebo i pouze podezřelé reakce se ověřují specifičtějšími, tzv. konfirmačními reakcemi.

26 Aglutinace a precipitace: přehled

27 Precipitace a aglutinace – společné
Precipitace a aglutinace jsou dvě nejjednodušší serologické reakce, kde pracujeme opravdu jen s antigenem a protilátkou bez dalších složek Buďto tedy dokazujeme antigen zvířecí (či monoklonální*) protilátkou, nebo protilátku laboratorním antigenem Pouze ve druhém případě zjišťujeme titry! *vyrobenou klonální populací plazmatických buněk

28 Precipitace, aglutinace, aglutinace na nosičích
Precipitace: Antigeny jsou ve formě izolovaných makromolekul (jde tedy o koloidní antigen) Aglutinace: Antigen je součástí buňky mikroba (pracujeme tedy s.celými mikroby, říkáme, že antigen je korpuskulární) Aglutinace na nosičích: Původně izolované antigeny jsou navázány na cizí částici – nosič (latex, erytrocyt, polycelulóza)

29 Precipitace

30 Aglutinace

31 Aglutinace na nosičích

32 Aglutinace: příklady reakcí

33 Průkaz protilátek aglutinací v mikrotitrační destičce
Určete aglutinační titry u protilátek proti yersiniím Pozitivní – nepravidelný chuchvalec Negativní – malé pravidelné kolečko Nezapomeňte, že titr = nejvyšší ředění s pozitivní reakcí. První důlek je ředěn 1 : 100, druhý 1 : 200 atd.

34 Demonstrace aglutinační reakce u tularémie (z foto MiÚ LF MU a FN USA):
První řada: Aglutinát je viditelný v ředění 1:2 a 1:4, nikoli však již 1:8 a vyšším  titr je 1:4 Druhá řada: V žádném důlku není aglutinace  žádný titr, negativní reakce 1:2 1:4 1:8

35 Aglutinace na detekci protilátek proti yersiniím
K+ pozitivní, titr = 1 : 200 Č. 1 negativní Č. 2 pozitivní, tit. ³ 1 : 400 Č. 3 negativní Č. 4 pozitivní, titr = 1 : 200 1:100 1:200 1:400 1:800 Aglutinace Sedimentace volných bakterií

36 Příklad aglutinace na nosičích: Treponema pallidum pasivní hemaglutinace (TPHA)
Také zde je pozitivní reakce vznik „chuchvalce“, negativní sedimentace částic na dno důlku. Avšak je to červené: je to totiž aglutinace na nosiči, nosičem je erytrocyt Dnes se v tomto testu červené krvinky nahrazují polycelulózovými částicemi – můžete se pak setkat se zkratkou TPPA

37 Demonstrace TPHA (foto MiÚ LF MU a FN USA)
/- Demonstrace TPHA (foto MiÚ LF MU a FN USA)

38 Příklad sklíčkové aglutinace k antigenní analýze: Testování kmene E
Příklad sklíčkové aglutinace k antigenní analýze: Testování kmene E. coli, zda není Enteropatogenní Escherichia coli Člověk je tvor zdravě líný. Nikomu by se nechtělo zkoušet míchat testovaný kmen E. coli postupně se dvanácti séry. Proto Použijeme nejprve polyvalentní séra: nonavalentní sérum obsahuje protilátky proti devíti typům EPEC, trivalentní sérum IV proti zbývajícím třem. Tak je „pokryto“ všech dvanáct serotypů. Pozitivita = vločky Pouze pokud jedno ze sér je „+“, pokračujeme s (trivalentními a) monovalentními séry Pozitivita se projeví jako vločky v kapce Je to průkaz antigenu (přesněji antigenní analýza)  neurčují se tu žádné titry!

39 Průkaz EPEC – výsledek

40 Precipitace: příklady reakcí

41 Příklad průkazu protilátek precipitací – vyvločkovací reakce na syfilis – RRR
Detekujeme protilátky, které jsou pozitivní u syfilis, ačkoli to nejsou protilátky proti Treponema pallidum, nýbrž proti kardiolipinu (látka, která se objevuje u syfilitiků) Opět provádíme pouze kvalitativně. První důlek je pozitivní kontrola, druhý negativní, pak má každý pacient (jen!) jeden důlek Smíchá se vždy 0,05 ml séra + 0,05 ml kardiolipinu

42 RRR, RPR, VDRL Netreponemové testy, tedy průkaz nespecifických antikardiolipinových protilátek mohou být provedeny v různých formátech VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) je flokulační (precipitační) test na sklíčku. RRR (rychlá reaginová reakce), je obdobou (úpravou) reakce VDRL, používají se jamky Podobná je také reakce RPR (rapid plasma reagin), kde je odečítání reakce vylepšeno o makroskopickou vizualizaci pomocí karbonových částic, nebo pigmentů.

43 Precipitace – mikroprecipitace v agaru
Tzv. mikroprecipitace v agaru dle Ouchterlonyho Do důlku uprostřed je nalita tekutina obsahující antigen. Ten difunduje agarem. Obsahuje-li sérum protilátky, difundují proti němu a na jejich styku vznikne precipitační linie. + - Antigen 

44 Precipitace – prstencová precipitace k detekci antigenu
Do Pasteurových pipet zabodnutých v.plastelíně postupně naléváme: 1) zvířecí sérum s protilátkami 2) čtyři různé extrakty kmenů Pozitivita: prstenec na styku tekutin Obrázek je jen ilustrační! V praktiku nevyjde pozitivní první, ale jedno z dalších sér!

45 Konec Treponema pallidum, původce syfilis

46 Poznámka k E. coli Escherichia coli je bakterie, která je normální složkou střevní mikroflóry. Na svém povrchu má kromě jiných typů antigenů také takzvané tělové O-antigeny. (Jsou to koncové části polycharidických řetěžců lipopolisachidů vnější membrány G– bakterií) Tyto O-antigeny nejsou u všech kmenů E. coli stejné. Naopak, existují stovky takzvaných serotypů v rámci druhu E. coli Ze všech těchto serotypů jen přibližně dvanáct vykazuje vyšší patogenitu u novorozenců a kojenců. Těmto serotypům se souhrnně říká EPEC – enteropatogenní Escherichia coli

47 Nepřímý průkaz syfilis – přehled
TPHA – Tr. pasivní hemaglutinační test TPPA – dtto, místo krvinek polycelulóza Nepřímý průkaz syfilis – přehled Historický BWR – Bordet Wassermann Netr. Screeningové RRR – Rapid Reagin Test TPHA/TPPA* Treponemové Konfirmační ELISA FTA-ABS (nepř. imunofluor.) Western Blotting Historický, popř. superkonfirmace TPIT (Treponema Pallidum Imobilizační Test) = Nelson

48 Kontrolní otázky 1. V jakém typu vzorku se hledají protilátky?
2. V jakých typech vzorků se dají hledat antigeny? 3. Vysvětlete pojem „antigenní analýza“. 4. Znamená přítomnost protilátek vždy akutní infekci? 5. V jakých situacích se měří titry? 6. Jaký je rozdíl mezi precipitační a aglutinační reakcí? 7. Proč je nutno v případě pozitivity RRR reakce konfirmovat? 8. Lze aglutinační reakcí vyšetřit i protilátky proti koloidnímu antigenu? 9. Co znamená pojem "screeningová reakce"? 10. A ještě jedna  Hlavní obsah

49 KOMPLE-MENTFIXACE NEUTRA-LIZACE

50 Obsah této části prezentace
Dynamika titru Komplement a jeho vlastnosti Komplementfixační reakce (KFR), její princip Řešení problémů s KFR Příklady použití KFR v praxi Neutralizační reakce – princip Jednotlivé neutralizační reakce ASLO a jeho význam Kontrolní otázky

51 Dynamika titru

52 Interpretace serologických reakcí
Průkaz antigenu je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v těle pacienta Průkaz protilátek je nepřímá metoda. Jak odhadnout, kdy se mikrob s.tělem pacienta setkal: Množství protilátek (titr) a zejména změna tohoto množství (dynamika titru) Třída protilátek: IgM/IgG (více v J08) (Avidita protilátek)

53 Dynamika titru 1- akutní sérum 2 - rekonvalescentní 2 1
Průšvih je, že každý má jinou úroveň protilátkové odpovědi. Proto samotná hodnota titru mnoho neříká Změna titru vypovídá více. Jde-li o čerstvou záležitost, titr se vždy vyvíjí, nejprve stoupá, později zvolna klesá. 2 1

54 Proč nestačí samotný titr
Někdy se stane, že málo reaktivní pacient má i v akutní fázi titr dosti nízký Velmi reaktivní pacient naopak i dlouho po infekci titr relativně vysoký

55 Párová a nepárová séra Párová séra = první vzorek je uchováván v.ledničce, dokud nepřijde i druhý (10–21 dní). Pak jsou oba hodnoceny naráz. čtyřnásobný vzestup se v tom případě má za signifikantní pro akutní infekci. Séra nejsou párová (druhý vzorek je vyšetřen zvlášť): zvětšuje se riziko náhodné, chyby, proto se zpravidla vyžaduje ještě jednoznačnější důkaz než čtyřnásobný titr

56 Dynamika titru – další aspekty
Zvláštním případem je tzv. serokonverze – v prvním vzorku protilátky nejsou (ještě se nestihly vytvořit), v druhém už jsou. Takový důkaz je cennější než „důkaz čtyřnásobkem“ V některých případech místo vzestupu prokážeme pokles (subakutní infekce) Velikost titru rozhodně neodpovídá vývoji klinických příznaků. Množství protilátek často vrcholí, až příznaky zmizí.

57 Příklady různých projevů dynamiky titru
1 – 2: sérokonverze 3 – 4: vzestup titru 5 – 6: pokles titru

58 Komplement a jeho vlastnosti

59 Komplement součást nespecifické humorální imunity
složitý kaskádový systém

60 Komplementfixace (KFR)
Komplement = jedna ze složek imunitní reakce Pro KFR používáme morčecí komplement. Pacientův komplement je před reakcí inaktivován teplem Komplement není schopen vázat se na samotný antigen Komplement není schopen vázat se na samotnou protilátku Komplement je schopen vázat se pouze na KOMPLEX obou Jsou-li antigenem beraní erytrocyty a protilátkou králičí protilátky proti nim, dojde po navázání komplementu k hemolýze. Lze se o tom přesvědčit v jednoduchém úkolu, který je obsažen v praktickém cvičení.

61 Komplement a jeho vlastnosti

62 Komplement fixační reakce (KFR), její princip

63 Pohádka 1 Byl jednou jeden zvědavý hlídač v parku.
Chtěl vědět, jestli mládenec, který chodívá do parku ve stejnou dobu jako jedna slečna, k té slečně patří Uvažoval následovně: v parku je jediná lavička. Pokud patří k sobě, tak si jistě na lavičku sednou a budou se objímat Umístil proto na lavičku kudlibabky a řekl si, že pokud ti dva k sobě patří, nachytají na sebe při objímání kudlibabky z lavičky.

64 Pro ty, kdo nevědí, jak vypadají kudlibabky

65 Jak to ale poznat… …když mládenec i dívka odešli jiným východem?
Hlídač si uvědomil, že za chvíli přijde na návštěvu jeho neteř se svým přítelem. Jak je zná, určitě se cestou zastaví u lavičky a budou se objímat. Hlídač to vymyslel: pokud neteř s přítelem budou mít na sobě kudlibabky, pak je nevychytala ta první dvojice – žádná dvojice to nebyla. Pokud kudlibabky mít na sobě nebudou, tak k sobě první dvojice patří.

66 Poučení z naší pohádky Dnes máme na programu komplementfixaci, poměrně složitou reakci. Nejenže ke zviditelnění komplexu antigen-protilátka používáme komplement, ale navíc ještě přidáváme další dvě složky – tzv. indikátorovou dvojici. Tato dvojice je tvořena indikátorovým antigenem (beraní erytrocyty) a indikátorovou protilátkou (amboceptor = králičí protilátky proti beraním erytrocytům).

67 Princip KFR Sérum pacienta se smíchá s laboratorním antigenem (nebo, u přímé KFR, se smíchá pacientův vzorek se zvířecími protilátkami). Přidá se komplement. V pozitivním případě se naváže (je schopen se navázat jen pokud se vytvořil komplex Ag-Ig) Ve druhé fázi přidáme indikátorový systém (beraní erytrocyty + amboceptor). U pozitivní reakce indikátor zůstává nedotčen. U negativní reakce dojde k jeho hemolýze.

68 Princip KFR

69 Co dělá komplement s indikátorovým systémem
K hemolýze je nutná přítomnost beraních (ne králičích) erytrocytů, amboceptoru a komplementu. Chybí-li byť jediná složka, nebo je nahrazena jinou, k hemolýze nedojde. Beraní ery + amboceptor bez komplementu  není hemolýza Beraní ery + komplement bez amboceptoru  není hemolýza Králičí ery + komplement + amboceptor  není hemolýza Beraní ery + komplement + amboceptor  hemolýza

70 Použití KFR KFR lze použít pro diagnostiku mnoha, zejména virových infekcí Jako i jiné serologické reakce se KFR používá k průkazu antigenu či protilátky Pro zjednodušení uvádíme v tomto praktiku pouze průkaz protilátky Berme to tedy tak, že máme laboratorní antigen, který konfrontujeme se sérem pacienta (kde hledáme protilátky)

71 Řešení KFRůserů

72 Problémy s KFR Příliš mnoho komplementu  falešná negativita. Co dělat? Titrovat komplement Některá složka séra sama o sobě vyvazuje komplement (složka antikomplementarity): falešně pozitivní výsledky. Co dělat? Provést test antikomplementarity, tj. vše jako v normální reakci, ale bez antigenu (V pohádkovém příběhu odpovídá bezdomovci, který zválí lavičku a sám na sebe nachytá všechny kudlibabky, a to i tehdy, když je chlapec nemocný a do parku vůbec nepřijde)

73 Titrace komplementu Pro reakci potřebujeme množství morčecího komplementu, které není moc velké ani malé. Proto zjišťujeme, jaké množství komplementu hemolyzuje pracovní jednotku krvinek s amboceptorem (hemolytická jednotka) Příliš mnoho komplementu  falešná negativita (příliš mnoho kudlibabek  zbude i na neteř a jejího přítele)

74 Test antikomplementarity
NENÍ

75 Příklady použití KFR v praxi

76 Klinická situace A Pacient s dlouhotrvajícími respiračními problémy, málo klinických projevů, nejpravděpodobnější diagnóza atypické pneumonie Atypická pneumonie může být způsobena mnoha respiračními viry, avšak také některými bakteriemi (Mycoplasma, Chlamydia) Případná mykoplasmová/chlamydiová etiologie by znamenala účinek antibiotik. U virů by antibiotika smysl neměla.

77 Respirační patogeny Celá serologická destička patří jednomu pacientovi. Máme šest respiračních patogenů, každý je ve dvou řádcích (akutní vzorek a rekonvalescentní). První sloupec je test antikomplementarity Následuje sedm ředění séra – ve druhém sloupci 1 : 5 a pak geometrickou řadou s.koeficientem dva. Kromě virů je ve škále i bakterie Mycoplasma pneumoniae

78 Klinická situace B Máme tři pacienty s podezřením na klíšťovou encefalitidu, všichni mají neurologické potíže a anamnézu přisátí klíštěte Klíšťová encefalitida je nemoc poměrně běžná ve střední Evropě. Ačkoli má horší průběh u dospělých (zejména seniorů), lidé pohříchu nechávají očkovat spíše své děti než své rodiče.

79 Klíšťová encefalitida – příklad průkazu
Opět testujeme protilátky, tentokrát proti klíšťové encefalitidě. v prvním řádku je pozitivní kontrola ve 2. a 3. řádku první pacient ve 4. a 5. řádku druhý pacient v 6. a 7. řádku třetí pacient První z obou řádků vždy odpovídá akutnímu, druhý rekonvalescentnímu vzorku séra. V prvním sloupci jsou opět testy antikomplementarity, následuje ředění geometrickou řadou od ředění 1 : 4

80 Klinická situace C Máme několik pacientů, kteří mají být prověřeni na protilátky proti toxoplasmose (Toxoplasma gondii je tkáňový parazit, jeho definitivním hostitelem je kočka) Seronegativita znamená, že se pacient nikdy s infekcí nesetkal*. Seropozitivita vyžaduje bližší zkoumání (další odběr, event. ELISA pro ověření třídy protilátek) *nebo to bylo tak nedávno, že se ještě nestihly vytvořit protilátky.

81 Toxoplasmosa – příklad průkazu protilátek
Destička patří pozitivní kontrole (první řádek) a šesti pacientům (druhý až sedmý řádek). Hledáme protilátky proti toxoplasmose. V prvním sloupci jsou opět testy antikomplementarity, následuje ředění geometrickou řadou od ředění 1 : 8. V tomto případě nesledujeme dynamiku titru (každý pacient má jen jeden řádek).

82 Neutralizační reakce – princip

83 Pohádka 2 Byl jednou jeden krvežíznivý toxin, a ten dostal chuť na červenou krvinku Tento toxin měl ovšem zároveň vlastnosti antigenu, proti kterému se tvoří protilátky A jak se tak ten toxin chystal rozbít krvinku, postavila se před něj protilátka, navázala se na něj a nedovolila mu krvinku rozbít Červená krvinka se radovala, a spolu se sestřičkami vesele sedimentovala na dno

84 Poučení z naší pohádky Dnes máme na programu též neutralizaci
Tato reakce se uplatní v případě virů nebo bakteriálních toxinů, které mohou být přímo neutralizovány příslušnou protilátkou Celá bakterie se zpravidla jen tak jednoduše neutralizovat nedá Většina aplikací neutralizace je tedy ve virologii. Výjimkou je však nejběžnější serologická reakce vůbec – reakce ASLO

85 Neutralizační reakce: obecný princip
Protilátky fungují několika způsoby. Jeden z nich je přímá neutralizace. Tento způsob se zřídka vidí u celých bakterií. Pozorujeme ho u virů nebo bakteriálních toxinů Nicméně někdy protilátky neutralizují i určitou charakteristiku celé bakterie, např. pohyblivost Treponema pallidum u tzv. Nelsonova testu (TPIT).

86 Neutralizace schématicky
Protilátka (Ig) brání efektu toxinu/viru na buňku / krvinku + – Buňka ve tkáňové kultuře či červená krvinka Buňka ve tkáňové kultuře či červená krvinka Toxin či virus Protilátka Toxin či virus

87 Příklady neutralizačních reakcí
Neutralizován Objekt Reakce Toxin bakterie (hemolyzin) Erytrocyt hemolýza ASLO Virus Erytrocyt shlukování HIT Buňka efekt metabolický VNT

88 Jednotlivé neutralizační reakce

89 ASLO Princip: Protilátka blokuje hemolytický efekt toxinu (streptolyzinu O) na krvinku. Pozitivní je tedy zábrana hemolýzy se sedimentací krvinek (podobně, jako u KFR, ale ze zcela jiného důvodu) Panel se odečítá naležato. Obsahuje pozitivní kontrolu a sedm pacientů. Titr nad cca 200 znamená riziko, že pacient je ohrožen pozdními následky streptokokové infekce.

90 Postup ředění séra – ASLO
Jinak obvyklý postup (ředění geometrickou řadou s koeficientem 2) by byl v tomto případě příliš hrubý, potřebujeme jemnější ředění. Jde sice o geometrickou řadu, avšak s koeficientem pouze 1,2 (a to ještě přibližně)

91 HIT Hemaglutinačně Inhibiční Test
Protilátka neutralizuje virové shlukování krvinek (in vitro vlastnost většiny virů) Shluk krvinek („bramboroid“) = negativní výsledek. Sedimentace = pozitivní Příklad použití: Můžeme odečíst HIT u klíšťové encefalitidy – u každého pacienta akutní a rekonvalescentní sérum. Interpretace výsledků párových sér je u neutralizace samozřejmě stejná jako u kterékoli jiné reakce

92 Zapamatujte si: HIT není aglutinace, ale neutralizace virového shlukování krvinek HIT se liší od reakce ASLO především tím, že krvinky nejsou hemolyzovány, ale shlukovány. Stejné je naopak to, že specifická protilátka dokáže příslušnému efektu zabránit Průkaz protilátek proti klíšťové encefalitidě pomocí HIT je „už zase“ klasický nepřímý průkaz (na rozdíl od ASLO)

93 HIT u klíšťové encefalitidy: příklad klinické situace
Máme několik pacientů s podezřením na klíšťovou encefalitidu, již testovaných pomocí komplementfixace Nyní jsme se rozhodli k ověření výsledků provést nezávislý test

94 VNT (nepleťte si to s TNT  )
Virus Neutralizační Test Buněčná kultura bývá poškozena virem. Poškození virem  změna pH  změna barvy ze žluté na červenou (pro zapamatování: buňky, zprzněné virem, se rdí, ač svému neštěstí nemohly zabránit) Jsou-li přítomny protilátky, mohou tomuto zprznění buněk zabránit. Buňky tedy nemají důvod se rdít a zůstávají žluté

95 VNT – klinická situace Pacient R. S., 35 let, má chronickou hrudní bolest. Kardiologické vyšetření ukázalo podezření na zánět srdečního svalu (myokarditidu) Jelikož coxackieviry jsou častými původci myokarditid, bylo rozhodnuto prověřit přítomnost protilátek proti těmto virům

96 VNT – příklad použití u coxsackievirů
Celý panel patří vyšetření jednoho pacienta. Liché řádky = akutní sérum, sudé = rekonvalescentní. Co dva řádky, to jeden coxsackievirus (B1 až B6) V prvním sloupci je ředění 1 : 5, dále opět 1 : 10 atd. V posledním sloupci jsou kontroly. Je-li v tomto sloupci šest žlutých a šest červených důlků, je vše v pořádku Titr je určen posledním důlkem, který má nezměněnou (žlutou) barvu Vyjde-li u dvou coxsackievirů signifikantní (alespoň čtyřnásobný) vzestup titrů, může sice jít o koinfekci, pravděpodobnější je však zkřížená reaktivita u toho coxsackieviru, kde je nižší titr

97 ASLO a jeho význam

98 Co je to antistreptolyzin O a proč ho prokazujeme
Po každé streptokokové infekci se objevují protilátky, často včetně protilátek proti streptokokovému toxinu – streptolyzinu O. Někdy se však stane, že množství těchto protilátek po infekci neklesá, naopak stoupá. Protilátky se totiž vážou na některé struktury hostitelského organismu (autoimunita), roztáčejíce „bludný kruh“. V takovém případě jsou tedy paradoxně nebezpečnější protilátky než patogen, proti kterému nás měly chránit.

99 Pamatujte: ASLO není nepřímý průkaz, přestože hledáme protilátky. Nepátráme tu po patogenovi, určujeme samotné protilátky, jež mohou být nebezpečné Indikací k vyšetření ASLO je podezření na tzv. pozdní následky streptokokových infekcí – akutní glomerulonefritida či revmatická horečka

100 Revmatická horečka

101 Akutní glomerulonefritis
Difusní zánětlivá buněčná infiltrace a mesangiální hypercelularita (barvení hematoxylin-eosin, původní zvětšení 200×)

102 Akutní glomerulonefritis II
iws.ccccd.edu

103 Princip vyšetření ASLO: neutralizace hemolýzy
Všimněte si, že v.angličtině se ASLO označuje jako ASO. Zrada je, že zkratka ASLO přitom také existuje a označuje stafylolyzin.

104 Konec

105 Virus klíšťové encefalitidy
Klíšťová encefalitida sice postihuje často děti, závažné příznaky má však spíše u dospělých. Přesto se dospělí málokdy nechají očkovat. V první fázi připomíná chřipku, ve druhé příznaky meningeální či mozkové. Smrtnost infekce je 1–5 %. Jde o typický arbovirus, zdrojem jsou hlodavci Diagnostika je nejčastěji nepřímý průkaz

106 Další flavivirové encefalitidy a horečky
Kromě středoevropské klíšťové encefalitidy existují ještě další klíšťové encefalitidy. Ruská jaroletní je druhým podtypem k té naší, trochu méně příbuzná je skotská „louping ill“ a omská hemorrhagická horečka. Dále existuje japonská encefalitida, kterou přenášejí komáři rodu Culex. S ní je příbuzná také západonilská horečka, kterou rovněž přenášejí komáři. Zřejmě se vyskytuje i jako domácí onemocnění v okolí Lanžhota.

107 Klíště Ixodes ricinus

108 Virus klíšťové encefalitidy

109 Toxoplasma gondii Je to prvok, který je přenášen kočkami, i když chovatelé psů jsou ve větším riziku (protože na srsti donesou domů částečky kočičího trusu) Většina infekcí u imunokompetentních osob je bez příznaků nebo se projeví jen zvětšenými uzlinami, které zase odezní Nebezpečná je oční forma Nebezpečná je také infekce plodu, zejména v.prvním trimestru

110 Toxoplasma gondii

111 Životní cyklus toxoplasem
Dole: toxoplasmová cysta v mozku

112 Toxoplasma gondii

113 Toxoplasma – životní cyklus

114 U některých osob ovšem může vzniknout například toxoplasmová retinitida…

115 Smrtnost (letalita) a úmrtnost (mortalita)
Smrtnost čili letalita je podíl osob, které umřou na určitou nemoc, k celkovému počtu nakažených touto nemocí Úmrtnost čili mortalita je naopak průměrný počet osob, které zemřou na tuto nemoc (obvykle vyjádřený na 100 000 obyvatel a jeden rok)

116 Coxsackieviry: přehled čeledi Picornaviridae
Do čeledi Picornaviridae patří z virů významných pro člověka patří do této čeledi především enteroviry, (název ukazuje na fekálně-orální přenos většiny z nich, ale vlastní infekce probíhají spíše mimo střevo!) dále se dělí na polioviry – viry dětské obrny coxsackieviry a echoviry novější enteroviry 68, 69, 70 a 71 rhinoviry – viry rýmy virus hepatitidy A

117 Coxsackieviry – více o nich
Existují coxsackieviry A1–A22, A24 a B1–B6 Diagnostika spočívá v izolaci viru na novorozených myšatech či tkáňových kulturách Nepřímá diagnostika je obtížná kvůli zkříženým reakcím; používá se vlastně jen u skupiny B při podezření na myokarditidu

118 Coxsackieviry – patogenita
CNS: aseptické meningitidy (většina typů) herpangina (A typy, hlavně A4) tzv. hand-foot-mouth disease (A16) dýchací infekce (všechny typy) myokarditida a jiné svalové choroby (B typy) lymfadenitida (všechny typy) souvislost s některými typy diabetes mellitus (skupina B)?

119 Kontrolní otázky Hlavní obsah
Proč se pro KFR nepoužívá pacientův vlastní komplement a používá se místo toho morčecí? Jaké typy chyb vyvolává antikomplementarita séra? Jaké typy chyb vyvolává příliš velké množství komplementu? Proč nelze dvojnásobný vzestup titru považovat za signifikantní? (Uvažujte o chybě měření) Proč je u reakcí, jako je KFR, doporučeníhodné používat párová séra? Co znamená termín „serokonverze“? V jakých klinických situacích má význam vyšetřovat ASLO? Proč není vhodné hovořit o ASLO jako o „nepřímé metodě detekce mikroba“ navzdory faktu, že jde o průkaz protilátek? Každý virus nemá schopnost aglutinovat erytrocyty – jak to ovlivní možnost použití HIT v diagnostice? Jaká je anglická zkratka reakce ASLO ? Proč se neutralizační reakce jen zřídka používají v bakteriologii? A ještě jedna  Hlavní obsah

120 REAKCE SE ZNAČENÝMI SLOŽKAMI

121 Obsah této části prezentace
Úvod (pohádka) Třídy protilátek Reakce se značenými protilátkami: přehled Imunofluorescence a RIA ELISA: princip ELISA: praktické odečítání Imunobloty (Western blotting) Imunochromatografické testy Kontrolní otázky

122 Pohádka Byla jednou jedna námořnice*, a ta měla na palubě různé věci přivázané, aby jí neodplavaly. Dalekohled měla přivázaný na záchranné kolo, to zase na záchranný člun, a ten byl připevněný k palubě. A tak to vydrželo i největší vlny. Jednou se na palubě objevil její muž. Chtěl si vyzkoušet záchranné kolo. Odvázal z něj dalekohled a odvázal ho z člunu. Přišla vlna – a dalekohled uplaval. *Původní pohádka o námořníkovi a jeho ženě byla upravena v rámci boje s genderovými stereotypy.

123 Poučení z naší pohádky Reakce se značenými složkami jsou založeny na tom, že postupně navazujeme jednotlivé složky reakce po každém kroku reakce probíhá promytí Promytí odstraní vše, co není navázáno Negativní reakce je taková, ve které chybí jeden článek řetězce postupně na sebe navázaných složek. Další složky už pak nejsou spojeny s povrchem, a tak jsou při promytí odstraněny.

124 Třídy protilátek

125 Průběh protilátkové odpovědi
Protilátky IgM se tvoří jako první, ale také jako první mizí. Neprocházejí placentou  jejich nález u novorozence je svědectvím jeho infekce Protilátky IgG se tvoří později a zůstávají jako imunologická paměť přítomny dlouhodobě. Procházejí placentou (novorozenec je tedy může mít od matky)

126 Protilátky ostatních tříd
Protilátky třídy IgA se uplatňují hlavně u slizniční imunity, a tedy u infekcí, kde branou vstupu je sliznice (například gastrointestinální). U některých infekcí se vyšetřují místo protilátek IgM (například u toxoplasmosy) Protilátky třídy IgE se vyskytují u alergií a infestací červy. Zpravidla se však nestanovují specifické IgE proti nějakému patogenovi S protilátkami IgD se v mikrobiologii nepracuje

127 Reakce se značenými protilátkami: přehled

128 Reakce se značenými složkami
Na povrch se postupně navazují jednotlivé složky Místo jedné ze složek se pokusíme navázat vzorek od pacienta, o kterém si myslíme, že danou složku možná obsahuje Je-li to pravda, složka se naváže Pokud se všechny složky postupně navážou, vznikne nepřerušený řetězec Na konci řetězce je vhodné značidlo

129 Promytí a jeho význam Pokud by v reakci zůstalo přítomno i to, co se na nic nenavázalo, nedokázali bychom odlišit pozitivní reakci od negativní Proto po každém kroku reakce následuje promytí, po kterém zůstanou přítomny pouze složky navázané na pevný povrch Je-li řetězec přerušen, odplaví promytí vše za místem přerušení

130 Příklad pozitivního a negativního průběhu
Pacientův vzorek + Laboratorní protilátka Hledaný antigen Značená laboratorní protilátka (detekce) – Laboratorní protilátka Antigen chybí Značená laboratorní protilátka Není navázaná  je odplavena  nemůže být detekována POVRCH (sklíčko nebo dno důlku v destičce pro serologii)

131 Typy značidel Fluorescenční barvivo je značidlem u imunofluorescence
Radioizotop je značidlem u reakce RIA Enzym je značidlem u reakce ELISA Western blotting je zvláštním případem reakce ELISA, kde jednotlivé antigeny jsou elektroforeticky rozděleny Používáme-li jako značidlo enzym, je poslední složkou přidanou do reakce ještě příslušný substrát – tedy jeden krok navíc.

132 Imuno-fluorescence a RIA

133 Imunofluorescence

134 Imunofluorescence

135 Pozitivní výsledek u přímé i nepřímé imunofluorescence vypadá stejně

136 Příklady imunofluorescence (diagnostika Treponema pallidum)
Výhoda: Povrchem je tu podložní sklíčko. To nám umožňuje vidět tvar mikroorganismů. Přímá imunofluorescence (Povrch)-(antigen)-(značená protilátka) Nepřímá imunofluorescence (Povrch)-(antigen)-(protilátka)-(značená protilátka proti lidské protilátce)

137 Reakční schémata u imunofluorescence
A: Treponema pallidum – od pacienta B: Značená protilátka proti Treponema pallidum (laboratorní) C: Treponema pallidum – z laboratoře D: Protilátka proti Treponema pallidum – od pacienta E: Značená labor. protilátka proti lidské protilátce (konjugát)

138 Radioimunoesej (RIA) darc.tbzmed.ac.ir

139 ELISA: princip

140 ELISA

141 ELISA virology-online.com

142 ELISA – proč je tak oblíbená
U reakce ELISA je na konci celého procesu enzymatická reakce. Její intenzita se projeví jednoduše: intenzitou zbarvení v.důlku, kde reakce probíhá. Sytá barva = vysoce pozitivní. Nenáročnost z hlediska nákladů a nulové radiační nebezpečí je výhodou oproti radioimunoassayím Možnost automatizace a menší požadavky na odečítajícího jsou velkou výhodou oproti imunofluorescenci

143 Možnosti uspořádání složek bleděmodře vždy složka pocházející ze vzorku získaného od pacienta
Povrch-antigen-protilátka-značidlo (P) Povrch-protilátka-antigen-protilátka-značidlo (P, např. průkaz HBsAg) Povrch-antigen-protilátka-antigen-značidlo (N) Povrch-antigen-protilátka-konjugát-značidlo (N) Konjugát je značená protilátka namířená proti lidské protilátce

144 Význam konjugátu Konjugát se používá zpravidla u reakcí nepřímého průkazu (průkaz protilátek) Je to protilátka, pro kterou je antigenem lidská protilátka, např. IgM nebo IgG Dokáže být selektivní proti určité třídě lidské protilátky Použití konjugátu je tedy podstatou možnosti selektivního průkazu jednotlivých tříd protilátek

145 ELISA k detekci protilátky: 1. Pozitivní (hledá se IgM, IgM přítomna)
Všechny složky se postupně navazují. Dojde k.enzymatické reakci – změně barvy v důlku

146 ELISA k detekci protilátky: 2
ELISA k detekci protilátky: 2. Negativní I (hledá se IgM, žádné protilátky) V séru pacienta nejsou protilátky. Konjugát je odplaven, v důlku není žádná změna.

147 ELISA k detekci protilátky: 3
ELISA k detekci protilátky: 3. Negativní II (hledá se IgM, přítomny IgG) V séru pacienta jsou jen IgG protilátky. Konjugát je odplaven, ke změně barvy důlku nedojde

148 ELISA: praktické odečítání

149 ELISA – praktické provedení
Zpravidla máme k dispozici destičku s.jamkami. Na rozdíl od klasických serologických reakcí má každý pacient nikoli celý řádek, ale jen jeden důlek. To proto, že nezjišťujeme titry Před vlastními důlky pacientů mohou být důlky: Bl – blank (pro kalibraci spektrofotometru) K- a K+ – pozitivní a negativní kontrola Cut off (c. o., dva či tři důlky) – „odsekávají“ pozitivní výsledky buď ostře, nebo s rozmezím plus mínus 10 %) Výrobce dodává „vzorky“ s negativní (K–), pozitivní (K+) a právě hraniční (c. o.) hodnotou absorbance Vždy záleží na konkrétní reakci ELISA a jejím provedení. Někdy chybí blank, někdy není cut off přímo obsažen v destičce, ale počítá se jako průměr negativních kontrol + konstanta.

150 ELISA – ukázka (foto MiÚ LF MU a FN USA)

151 Příklad reakce ELISA k průkazu antigenu (antigen Helicobacter pylori)
U reakce ELISA je na konci celého procesu enzymatická reakce. Její intenzita se projeví intenzitou zbarvení v.důlku, kde reakce probíhá Intenzitu zbarvení lze měřit spektrofotometricky Za pozitivní se považují hodnoty vyšší než referenčně daný tzv. „cut off“ Obvyklý princip: Povrch-protilátka-antigen-protilátka-enzym-substrát

152 Příklad reakce ELISA k průkazu protilátek
U nepřímého průkazu reakcí ELISA se zpravidla hodnotí zvlášť protilátky IgM a IgG V daném případě se místo IgA používá IgM Za pozitivní se opět považují hodnoty vyšší než referenčně daný tzv. „cut off“ Často existuje pole hraničních hodnot, např. výsledky mezi 90 % a 110 % cut off se hodnotí jako „hraniční“, pod 90 % jako „negativní“, nad 110 % jako „pozitivní“ Princip zpravidla: Povrch-antigen-protilátka-konjugát-enzym-substrát

153 Příklad uspořádání reakce ELISA při průkazu protilátek
BL 4 K- 5 6 K+ 7 8 1 9 2 10 3 11 IgA IgG

154  Western blotting

155 Western blotting Název – slovní hříčka (badatel Southern)
Prakticky je to ELISA, ale směs antigenů je rozdělena elektroforeticky na jednotlivé antigenní determinanty Je tedy přesnější a pomáhá zejména tam, kde klasická ELISA troskotá na zkřížené pozitivitě např. příbuzných mikroorganismů V rámci serologických reakcí je výjimečný tím, že se nepoužívá k průkazu antigenu (jen protilátky)

156 Western blotting – princip
1: původní antigen (směs) 2: uvolnění jednotlivých antigenů detergentem 3: elektroforetické rozdělení antigenů 4: „přesátí“ rozdělených antigenů na nitrocelulózu 5: reakce ELISA (přítomny jsou jen některé protilátky)

157 Western blot – vzhled (obrázek z foto MiÚ LF MU a FN USA)

158 Příklad odečtení Western blotu (u lymeské boreliózy)
Jsou-li přítomny alespoň dva specifické pruhy (zvýrazněné na šabloně)  hodnotí se jako pozitivní Výjimky: u IgG stačí, je-li pozitivní jen jeden pruh, je-li to pruh vlsE (je vysoce specifický) u IgM stačí, je-li pozitivní jen jeden pruh, je-li to pruh ospC (je vysoce specifický)

159 Imuno-chromatografické testy

160 Imunochromatografické testy
Imunochromatografické testy jsou založeny na navazování jednotlivých komponent podobně jako předchozí Důležitým rozdílem je, že zde není promytí. Některé komponenty jsou navázány na povrch na určitých místech (testovací a kontrolní místo), další se hned naváží na testovanou složku a spolu s ní cestují porézní vrstvou. V pozitivním případě je zpravidla pozorován proužek u testu i u kontroly, v negativním jen u kontroly.

161 Příklad principu imunochromatografického testu

162 Princip (jen jedna z možností)
Testovací oblast Kontrolní oblast + –

163 Vysvětlení k předchozí animaci
V pozitivním případě jsou některé značené protilátky navázány na antigen, a uchytí se v testovací oblasti. Některé další molekuly dojdou až do kontrolní oblasti V negativním případě všechny značené protilátky přicházejí do kontrolní oblasti protilátka fixovaná k povrchu značená protilátka + antigen značená protilátka protilátka proti značené protilátce

164 Výhody imunochromatografických testů
Jsou velmi rychlé (desítky minut) Jsou velmi jednoduché  některé se nedělají v laboratoři, ale přímo u pacienta Jsou dostatečně přesné Mohou být použity pro mnoho účelů (všetně mimomikrobiologických, například těhotenský test) Nevýhoda: jsou poměrně drahé ve srovnání s tradičními testy

165 Typický mikrobiologický příklad
Clostridium difficile je důležitý střevní patogen. Je to anaerob, žijící i za normálních podmínek ve střevě. Za určitých okolností (zpravidla širokospektrných antibiotik, zejména linkosamidů) C. d. se přemnoží a jeho toxiny jsou nadprodukovány Testy produkce obou toxinů (A/B) ukazují pozitivitu obou modrých proužků (testovacího i kontrolního). Pozitivita pouze kontrolního proužku ukazuje, že test je v pořádku, je však negativní.

166 Konec (Obraz s názvem Protilátka)

167 Treponema pallidum Spirocheta, původce syfilis
Syfilis je klasická pohlavní nemoc. Přenáší se výhradně sexuálně. Jde ovšem o systémové onemocnění – v pokročilých stádiích postihuje celé tělo postiženého člověka (gummata, disekce aorty, neurolues, psychické příznaky) Některé poddruhy T. pallidum a některá jiná treponemata způsobují jiné choroby (framboesie – yaws, T. pertenue) Některá treponemata jsou i nepatogenní

168 Borrelia burdorferi sensu lato
Borrelia burdorferi sensu lato Jiná spirocheta, způsobující Lymeskou nemoc (podle města Old Lyme v USA) a dále klasifikovaná na Borrelia burgdorferi sensu stricto (= „v užším slova smyslu“), Borrelia garinii, Borrelia afzelii a další Nemoc je charakterizována tzv. erythema migrans, pak obvykle následují další příznaky Zatímco v USA se vyskytuje zejména B. b. sensu stricto a typické jsou kloubní příznaky, v Evropě jsou častější B. garinii a B. afzelii a typická je neuroborrelióza Kromě lymeské nemoci vyvolávají borrelie (jiné druhy) návratnou horečku (B. duttoni, B. recurrentis)

169 Helicobacter pylori Peptické (tedy gastrické či duodenální) vředy jsou onemocněním, které vzniká souhrou více příčin. Takovým onemocněním říkáme obvykle multifaktoriální. Dodnes se nejen mezi praktickými lékaři, ale i mezi specialisty liší názory na podíl spirálovité tyčinky (ne spirochety!) Helicobacter pylori na vředové onemocnění. Jisto je, že jsou i zdraví lidé s helikobakterem, stejně tak je ale jisto, že helikobakter svůj, nikoli nevýznamný, podíl na onemocnění má.

170 Kontrolní otázky Hlavní obsah
1. Jakou diagnostickou hodnotu přisuzujete nálezu antigenu metodou ELISA a nálezu protilátek stejnou metodou? Uvažujte obecně. 2. Jaký klinický materiál je vhodný pro průkaz antigenu a jaký pro průkaz protilátek? 3. V čem se liší a v čem jsou společné reakce ELISA a western blot? 4. Proč se u průkazu protilátek metodou ELISA zpravidla nepoužívá ředění séra geometrickou řadou ? 5. Jaký význam má (opět uvažujte obecně) průkaz protilátek tříd IgG, IgM a IgA? 6. Které protilátky procházejí placentou a které ne? 7. Proč není možno jednotlivé třídy protilátek prokazovat „klasickými“ sérologickými metodami (aglutinace, KFR, neutralizace)? 8. Existují i další mikrobiologické možnosti použití imunochromatografických testů kromě průkazu toxinu Clostridium difficile? 9. Co je to cut off? 10. Jak se nazývá přístroj, který se (kromě řady jiných využití) používá i k vyhodnocování výsledků reakcí ELISA? Hlavní obsah

171 VIRY I

172 Obsah této části prezentace
Viry Viry hepatitid HIV Diagnostika hepatitid a HIV infekce Praktické aspekty diagnostiky Kontrolní otázky

173 Viry

174 Příběh Kupte si ty broskve, paní, volal prodavač na exotickém trhu. Paní Jitka broskve koupila a odnesla do hotelu. V hotelovém pokoji si je chtěla oprat, ale ouha – neteče voda. Co teď? Paní Jitka zaváhala, ale chuť na šťavnaté broskve byla silnější. Několik jich sním, přece se nemůže nic stát. Po návratu z dovolené paní Jitka nápadně zežloutla…

175 Viníkem byl Virus hepatitidy A. Ale mohl to být také virus hepatitidy E – oba dva se přenášejí špinavýma rukama či neomytými potravinami. Kromě těchto hepatitid známe ještě jiné, které se přenášejí pouze krví či sexuálně Virové hepatitidy jsou různé, různé jsou i viry, které je způsobují. Společné však mají to, že jejich diagnostika musí respektovat skutečnost, že jsou to viry, a ne bakterie.

176 Jak vypadají viry

177 Co jsou to vlastně viry? Viry jsou nebuněčné částečky, vedou se diskuse, zda jsou to vůbec živé organismy O původu virů je několik teorií, není ani jisté, že vznikly všechny stejným způsobem Stejně jako buněčné organismy se snaží o „zachování rodu“, potřebují k tomu ale buňku cizího organismu Kromě lidských virů existují i viry zvířecí, rostlinné a viry baktérií (takzvané bakteriofágy) Mezi viry nepatří priony – chyby v bílkovině. Přesto je však zvykem probírat je ve virologii.

178 Rozdělení virů Podle nukleové kyseliny rozdělujeme viry na DNA viry a RNA viry Podle počtu vláken DNA/RNA jednovláknové (ss) a dvouvláknové (ds), u jednovláknových se ještě rozlišuje, zda se jedná o "plus" vlákno nebo "mínus" vlákno. Podle přítomnosti virového obalu se jak DNA, tak i RNA viry dělí na obalené a neobalené. Dále se klasifikují do čeledí a rodů, jako bakterie či živočichové; zato druhové názvy se zpravidla nepoužívají

179 Virová částice – virion
Virion není buňka. Viriony mají menší rozměry než většina buněk včetně bakteriálních: nejčastěji 20–300 nm Skladba virionu nukleokapsida nebo jádro a kapsida obal (u obalených virů) u některých odlišná, atypická skladba (VHB) Je-li virus právě přítomen v hostitelské buňce, jeho struktura a uspořádání je odlišná od viru vyskytujícího se ve vnějším prostředí

180 Nukleokapsida je přítomna u všech virů
skládá se z nukleové kyseliny (DNA, RNA) a bílkovinné kapsidy kapsidy mohou mít helikoidální (šroubovicovou), kubickou či jinou symetrii. viry s kubickou symetrií tvoří tzv. pseudokrystaly – pravidelné útvary, přičemž jednotlivé viriony v nich jsou například tvaru pravidelného dvacetistěnu.

181 Lipoproteionový obal mají jej pouze obalené viry.
je tvořen lipidickou dvojvrstvou, která pochází z hostitelské buňky (původně např. cytoplazmatická, jaderná membrána apod.), do které jsou včleněny virové proteiny v některých případech je obal připojen specifickou bílkovinou k jádru. obalené viry jsou méně odolné (hynou totiž při porušení obalu např. vyschnutím) Více o virech v bonusové části

182 Viry hepatitid

183 Viry hepatitid Existuje pět hlavních typů virových hepatitid VHA až VHE, které způsobují viry HAV až HEV. Každý patří do jiné skupiny, většina jsou RNA viry, ale virus hepatitidy B je DNA virus VHA a VHE (pomůcka: samohlásky) se přenášejí fekálně orální cestou (ruce), nepřecházejí do chronicity VHB, VHC a VHD (souhlásky ) – přenos krví, popř. sexuální (u VHC spíše nevýznamný), mohou přecházet do chronicity Kromě oněch pěti typů se občas hovoří i o dalších (viry hepatitidy G, GC, H apod.). Jejich zařazení a význam je však stále nejistý.

184 Přehled hepatitid Hepatitida Zařazení Přenos HAV Picornaviridae
fekálně-orální HBV Zvláštní skupina DNA virů sexuální, krví HCV (a HGV) Flaviviridae krví HDV Delta agens – viroid HEV Příbuzný kalicivirům

185 Virus hepatitidy A

186 Virus hepatitidy B

187 Virus hepatitidy B Pouhý prázdný HBsAg 22 nm
Kompletní virion (Daneho tělísko) 42 nm HBsAg, uvnitř delta agens (VHD) 35 nm

188 Virus hepatitidy C

189 Virus hepatitidy D virology-online.com/viruses/HepatitisD.htm

190 Virus hepatitidy E

191 Hepatitidy Jde o infekční záněty jater, lidově zvané žloutenky. Je ovšem nutno odlišit žloutenku jako přenosné virové onemocnění a žloutenku jako příznak, který je přítomen nejen při hepatitidě, ale i např. při obstrukci žlučových cest kameny Pacient má horečky, trávicí potíže, může být přítomno zežloutnutí skléry či kůže, změna barvy moče a stolice atd. Hepatitidy B, C a D mohou přecházet do chronicity, a někdy i být prekancerózou

192 Postižené orgány

193 Pacienti se žloutenkou
medicine.ucsd.edu/Clinicalimg/skin-jaundice.html.

194 Klasickým zdravotnickým problémem je zejména hepatitida typu B
přechází do chronicity, možnost cirhózy či karcinomu jater dříve možný přenos ve zdravotnictví, při dnešní úrovni zdravotnictví připadá v.úvahu jen sexuální přenos a (stejně jako u hepatitidy C) i. v. narkomanie screening hepatitidy B běžný v řadě situací (před operacemi, v těhotenství apod.)

195 Dva případy z hlášení KHS JMK (2008)
Žena nar. 1985, BK, nezaměstnaná, PP 28. 4. svědění kůže, teplota, ikterus sklér, 2. 5. hospitalizace na KICH FN Brno, v anamnéze před půl rokem abortus s kyretáží a extrakce zubu. Žena nar. 1986, BM, nezaměstnaná. PP 31. 3. bolesti pod pravým žeberním obloukem, svědění kůže, nevolnost. 15. 4. ikterus kůže a sklér, 14. 4. hospitalizace na KICH FN Brno. V anamnéze i. v. pervitin PP = první příznaky

196

197

198 pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-disease2.htm Nahoře: pacient se žloutenkou při hepatitidě B. Vpravo: žena z thajského uprchlického tábora, která má hepatom po hepatitidě, později na nemoc zemřela

199 Změny v játrech u VHB pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-disease2.htm

200 Rizikové faktory hepatitidy B
pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-disease2.htm

201 Vývoj počtu případů v USA
pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-disease2.htm

202 Prevence a léčba hepatitid
Očkování proti hepatitidě B je nyní součástí normálního očkovacího kalendáře Očkování proti hepatitidě A je dostupné a doporučené např. i při cestách do jižní Evropy či severní Afriky. Možné i současné očkování proti hepatitidě A + B U některých hepatitid se používá léčba pomocí interferonů Jinak se používají hepatoprotektiva (látky chránící játra) a jiná podpůrná terapie

203 HIV

204 Virus HIV Patří mezi tzv. retroviry, které disponují reverzní transkriptázou (enzym pro přepis RNA do DNA) Virus HIV existuje ve dvou typech s tím, že většinu infekcí způsobuje první typ viru Přenáší se krví, pohlavní cestou a také z matky na dítě Existuje řada léků proti viru HIV, avšak jejich účinnost je omezená.

205 Retrovirus 

206 Virus HIV – onemocnění Virus postihuje především buněčnou imunitu
Po nespecifické primární infekci nastává dlouhé období, kdy se „nic neděje“. Poté se postupně vyvíjí generalizovaná lymfadenopatie, objevují se postupně oportunní infekce a při určitém stupni infekce se již hovoří o rozvinutém onemocnění AIDS V případě AIDS nedominují vlastní příznaky. Hlavním projevem nemoci je nápadný výskyt oportunních infekcí (toxoplasmóza, pneumocystóza, různé mykózy aj.) a nádorů

207

208 Diagnostika hepatitid a HIV infekce

209 A nyní již diagnostika. Nejprve opakování
Cílem mikrobiologických metod je zpravidla detekce patogena, popř. určení jeho citlivosti na antimikrobiální látky (ale u virů zatím většinou ne) Přímé metody detekce celého mikroba (jako morfologické či fyziologické jednotky) detekce jeho části (antigenu, DNA) detekce jeho produktu (například toxinu) Nepřímé metody: detekce protilátek (pozitivita = kontakt s mikrobem v minulosti – týdny / měsíce / roky)

210 Přehled metod – a které využijeme v tématu J10:
Přímé metody (práce se vzorkem či kmenem) Mikroskopie – u virů obtížná Kultivace – u virů obtížná Biochemické metody – u virů se nepoužívají Průkaz antigenu (pomocí protilátky) Pokus na zvířeti (izolace, průkaz toxicity) Průkaz nukleové kyseliny Nepřímé metody (práce se vzorkem séra) Průkaz protilátek (pomocí antigenu)

211 Přímý průkaz virů Kultivace  izolace (virus se často nepomnoží, jen uchová živý). Vyžaduje živé buňky. Blíže v příští části. Mikroskopie: elektronoptická spíše pro výzkum než pro běžnou diagnostiku, ale i optická k průkazu něčeho, co viry dělají in vivo či in vitro (inkluze, cytopatický efekt) Biochemická identifikace nepadá v úvahu Pokus na zvířeti zde splývá s izolací viru Průkaz DNA – u virů > u bakterií Průkaz AG ve vzorku – u virů velmi běžný

212 Nepřímý průkaz virů Používá se hlavně KFR, různé typy neutralizací (HIT, VNT) a v poslední době především reakce se značenými složkami (hlavně ELISA) Pozor! Ne vše, kde se jako vzorek použije sérum, je nepřímý průkaz! U systémových viróz je často agens (nebo jen jeho antigen) v séru přítomno, a pak se dá sérum použít i pro přímý průkaz

213 Diagnostika hepatitid A, C, D, E
HAV. Stanovujeme metodou ELISA anti-HAV IgM s IgG, nebo IgM a celkové protilátky HCV. Rovněž stanovujeme IgM a IgG protilátky metodou ELISA, dále se používá PCR HDV. Prokazuje se delta antigen (HDAg), protilátky (anti-HD) či virová RNA PCR HEV. Opět průkaz IgM a IgG protilátek metodou ELISA, ve výzkumu je PCR

214 HAV 

215 Vývoj žloutenky typu A www-micro.msb.le.ac.uk/3035/HAV.html.

216 Zvláštnosti diagnostiky HBV
Ve středu virionu hepatitidy B je nukleokapsida, kde je umístěna DNA a bílkoviny. Významné jsou dvě dřeňové bílkoviny, které mají povahu antigenů: HBcAg a HBeAg Kromě toho má virus obal, který je zčásti tvořen dalším antigenem: HBsAg HBsAg je nadprodukován, takže v krvi kolují i prázdné obaly Do prázdného HBsAg může proniknout také delta agens – původce hepatitidy D

217 Delta agens Delta agens je viroid, částice s neurčitou virologickou klasifikací Delta agens může infikovat člověka buďto zároveň s virem hepatitidy B (koinfekce), nebo následně po takové infekci (superinfekce) Přítomnost delta agens podstatně zhoršuje prognózu virové hepatitidy

218 Kompletní viriony a prázdné HBsAg

219 Diagnostika HBV HBV má tři pro diagnostiku významné antigeny. Jen dva z nich však nalézáme v.séru: HBsAg a HBeAg. HBsAg se tvoří v nadbytku, takže je ho vždy v.séru hodně, proto se hodí pro screening Protilátky naopak můžeme stanovovat proti všem třem z nich: anti-HBs, anti-HBe i anti-HBc. Diagnostiku případně doplní PCR, průkaz jaterních enzymů aj. Z kombinace vyšetření plyne interpretace

220 pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-disease2.htm

221 pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-disease2.htm

222 Diagnostika viru HIV Prokazují se protilátky proti obalovým glykoproteinům pomocí ELISA testů. Pokud výsledek vyjde jako pozitivní, pošle se vzorek séra do referenční laboratoře, která výsledek ověří (konfirmuje) další reakcí ELISA a Western blottem. Do výsledků konfirmace je výsledek hodnocen jako „reaktivní“, nikoli jako „pozitivní“ Přímý průkaz lze provádět pomocí PCR. Izolace viru je dnes již možná, ale velmi náročná a běžně se neprovádí

223 Praktické diagnostické přístupy

224 Praktická diagnostika hepatitid a HIV infekce: ELISA
Ačkoli některé reakce ELISA slouží k průkazu antigenu a jiné k průkazu protilátek, praktický přístup je obdobný. Počítání cut off: průměr důlků cut off, nebo průměr negativních kontrol + konstanta Často cut off 10 ± % = hraniční hodnoty V některých případech, zvláště u diagnostiky VHA nevyšetřujeme protilátky IgM a IgG, nýbrž IgM a celkové protilátky. Je jasné, že negativní IgM a pozitivní celkové protilátky prakticky značí přítomnost protilátek IgG.

225 Praktická diagnostika hepatitid a HIV infekce: PCR
PCR se používá hlavně u diagnostiky HCV, případně HIV Postup je stejný, jako u jiných PCR

226 Konec >>> Lambda fág >>>

227 Více k virům Množení (replikace) virů
probíhá buď v jádře (většinou u DNA virů), nebo cytoplasmě (většinou u RNA virů) hostitelské buňky. před replikací se virus musí zbavit svých bílkovinných obalů vlastní průběh replikace závisí na konkrétním typu daného viru (RNA/DNA, jednovláknové – ss/ dvouvláknové – ds).

228 Jednotlivé možnosti replikace
U většiny DNA virů je DNA-polymerázami dotvořeno vždy komplementární vlákno U hepadnavirů (VHB) je DNA přepisována do RNA, podle té pak reverzní transkriptázou vzniká zase DNA U RNA virů se využívají RNA polymerázy U retrovirů (HIV) se podle RNA tvoří reverzní transkriptázou DNA, která je přepisována buněčnou RNA-polymerázou

229 Tvorba virových bílkovin
je nutná k tomu, aby se virus po replikaci mohl z buňky uvolnit a šířit se dál. vlastní tvorba bílkovin opět probíhá různě podle toho, o který typ viru se jedná v každém případě virus částečně využívá proteosyntetický aparát hostitelské buňky.

230 Jednotlivé možnosti tvorby bílkovin
+ss RNA: je možná přímá translace –ss RNA: musí se dotvořit + vlákno ds RNA: z – vlákna se dotváří + vlákno retroviry: reverzní transkriptázou se vytvoří DNA a pak už pracují buněčné polymerázy ds DNA: zpravidla se podle – vlákna tvoří + vlákno RNA ss DNA: dotvoří se druhé vlákno a pak je to už stejné jako u ds DNA

231 Viry závislé na jiných virech
Zvláštností jsou některé viry, které nemohou existovat bez spoluúčasti jiných virů Adenoasociované viry (AAV) patří mezi parvoviry. Replikace je možná pouze za přítomnosti pomocného viru (adenoviru) Virus hepatitidy D – delta agens – je viroid. Je to nekompletní částice, která je schopna přežití pouze v obalu viru hepatitidy B (tvořeném hlavně HBsAg).

232 Viry a vnější prostředí, desinfekce
některé viry jsou hodně citlivé (např. HIV) jiné jsou zato mnohem odolnější než bakterie (třeba rhinoviry). mnohé desinfekční prostředky, které působí na baktérie, nepůsobí na viry nebo jsou nutné vyšší koncentrace; týká se to zejména neobalených virů. Účinné bývají jodové preparáty a peroxidy. velmi odolné vůči desinfekci i vysokým teplotám jsou priony

233 Viry jako původci lidských nemocí
Dítě napadené cytomegalovirem

234 Možnosti přenosu virů Cesty přenosu jsou u virů rozmanité, jsou ovšem prakticky stejné, jako u bakterií máme viry přenosné kapénkovou infekcí, fekálně-orální cestou, sexuálním přenosem, přenašečem (klíště, komár) či krví (injekce). u většiny virů je také možný „vertikální“ přenos, to jest z matky na plod.

235 Faktory patogenity Na rozdíl od bakterií se u virů často nerozlišují jednotlivé patogenní struktury, spíše se virus jako celek považuje za patogenní částici. Tomu odpovídá i boj s infekcí, kdy protilátky často celou virovou aktivitu neutralizují. S tím také souvisí větší význam neutralizačních metod v diagnostice.

236 Průběh virové infekce u virů záněty probíhají jinak než u baktérií
souvisí to zejména s nitrobuněčným parasitismem virů zejména je menší účast granulocytů, větší účast lymfocytů, a význam buněčné imunity také složky nespecifické humorální imunity jsou odlišné (zejména interferony).

237 Latentní infekce hostitelská buňka sice umožní vniknutí viru do buňky
neumožní však jeho množení a uvolnění z buňky zato umožní jeho přežívání v buňce nebo dokonce včlenění do chromozomu. v některých případech může dojít později k aktivaci této latentní (skryté) infekce, takže infekce vlastně znovu vypukne typické je to u některých herpesvirů.

238 Viry a nádory Některé viry mají zřejmě vliv na vznik některých nádorů, zejména EB virus (původce infekční mononukleózy – podílí se na vzniku Burkittova lymfomu) a HHV8 spolu s HIV (vznik Kaposiho sarkomu), či lidský papilomavirus (HPV) – vliv na rakovinu děložního čípku Příčinou je to, že virový promotor v těchto případech může aktivovat expresi onkogenů lidských buněk, která by jinak byla potlačena (neprojevila by se).

239 Boj s viry I – antivirotika
Používají se jen u některých virů Zpravidla jen dílčí význam v terapii Mohou být celková či lokální (někdy i tatáž látka, např. acyklovir – HERPESIN) Testování citlivosti in vitro zatím spíše experimentální Z nejznámějších: acyklovir, famciklovir, ganciklovir (herpesviry), amantadin, rimantadin, oseltamivir, zanamivir (chřipka), azidotymidin, PMPA (virus HIV)

240 Boj s viry II – imunoterapie
Používá se možností pasivní imunizace (protilátky) i aktivní imunizace (očkování) Z očkování pravidelného kalendáře: Živé oslabené viry: spalničky, zarděnky, příušnice Neživé vakcíny: virová hepatitida B, dětská obrna (Salk) Z ostatních vakcín: vzteklina (profylaxe, ne prevence), klíšťová encefalitida, VHA atd. Z pasivní např. protilátky proti VZV, HBV

241 Kontrolní otázky 1. Jaký je význam "celkových protilátek proti HAV"? Kdy uvažujeme o infekci VHA? 2. Co znamená v sérologii slovo „konfirmace“? 3. Jakým způsobem probíhá konfirmace při diagnostice HIV? 4. Které jsou typické markery infekce hepatitidou B? 5. Která skupina osob je vysoce riziková z hlediska nákazy HCV? 6. Po jaké době po rizikové situaci (například kontakt s krví nebo sexuální styk bez kondomu) má smysl vyšetřit protilátky proti HIV? 7. Kde se skrývá viroid? 8. Které jsou typické metody pro diagnostiku infekce HCV? 9. Jaké jsou možnosti určování cut off u reakce ELISA? 10. Které typy hepatitid se přenášejí fekálně-orální cestou?

242 VIRY II

243 Obsah této části prezentace
Viry chřipky Další respirační viry Mykoplasmata Virus klíšťové encefalitidy Některé vlastnosti virů důležité pro diagnostiku Přehled virologické diagnostiky Mikroskopie ve virologii. Izolace virů Nepřímé metody ve virologii Kontrolní otázky

244 Příběh Pan Plicník ležel povadle už více než týden v nemocnici pro dlouhodobé dýchací obtíže. Shlukla se kolem něj skupinka mediků. Snaživě ho lechtali svými fonendoskopy a nesmělými prsty zkoušeli poklep. Nenašli však žádný patologický nález. Vtom se přihlásila studentka Pilňoušková. „Pacient má suchý kašel, fyzikální vyšetření nic neprokázalo. Nemohlo by jít o atypickou pneumonii?“ Asistent zazářil: „Výborně, no aspoň někdo že na to přišel!“

245 Atypické pneumonie Pojem se nyní považuje za zastaralý, nicméně se ho přidržíme pro popsání pneumonií, které se vyznačují pomalejším nástupem, spíše neproduktivním kašlem a častou absencí klasických fyzikálních příznaků (ale RTG nález je přítomen) nebývají způsobovány klasickými kultivovatelnými bakteriemi (Streptococcus pneumoniae) původci jsou respirační viry (vizte dále) atypické bakterie: Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia (Chlamydophila) pneumoniae, Legionella sp. V případě bakteriálních původců je možná antibiotická léčba (doxycyklin, makrolidy)

246 V rámci této prezentace jsou zmíněny viry
respirační viry chřipky A a B viry parachřipky RS viry adenoviry Mycoplasma pneumoniae – není virus, ale diagnostikuje se virologickými metodami virus klíšťové encefalitidy

247 Viry chřipky

248 Chřipka Chřipka je onemocnění celého těla, ale především dolních cest dýchacích. K obrazu chřipky nepatří rýma ani bolesti v krku, ale suchý kašel, vysoké horečky, schvácenost a bolesti svalů. Začíná často velice prudce. Nebezpečná bývá chřipka u imunosuprimovaných (především delší trvání), těhotných, starších osob. Na druhou stranu, některé subtypy postihují více mladé, zdravé lidi paradoxně právě kvůli příliš dobré imunitě. Uplatňují se zde tzv. cytokinové bouře jako vlastní příčina zdravotních komplikací Existuje chřipka A, B a C. Za většinu epidemií ovšem může virus chřipky A

249 Virus chřipky A

250 Influenzavirus A – antigeny
Z vlastností viru chřipky je nejdůležitější antigenní proměnlivost. U viru chřipky se rozeznává 15 podtypů podle hemaglutininového antigenu (H) a 9 podtypů podle různé neuraminidázy (N). Je možný antigenní posun – drift, tedy přírodní mutace genů pro kódování antigenních determinant, nepřináší zcela nový typ viru Je také možná antigenní výměna – shift: dojde k přeskládání (reassortment) například mezi ptačím a lidským kmenem viru, takže vznikne zcela nový typ viru. Je možný jen u chřipky A, protože ostatní typy jsou čistě lidské Shift je umožněn segmentovaným genomem

251 Virus chřipky gustavorinaldi.blog.lastampa.it

252 Chřipkové pandemie Jak se viry mění, občas se objeví nová varianta a nikdo proti ní není chráněn. Takový virus je pak schopen vyvolávat epidemické výskyty, epidemie či dokonce pandemie na velkých územích. Samozřejmě, konkrétní průběh nelze nikdy předpovědět dopředu. Viry schopné epidemického výskytu v lidské populaci musí mít nejen zvýšenou virulenci, ale také schopnost přenosu z člověka na člověka. U ptačích virů taková schopnost zpravidla chybí. Jako „mixážní nádoba“ obvykle (ne ale nutně) slouží prasata. Ptačí faktory virulence se tedy stávají nebezpečnými až po promíchání či rekombinaci s částmi savčích virů.

253 Chřipkové pandemie 2 Během 1. světové války zahynulo mnoho lidí na tzv. španělskou chřipku Během dalších desetiletí proběhlo několik relativně menších epidemií (Hongkongská chřipka, Singapurská chřipka) Nedávná epidemie („prasečí chřipka“) byla způsobena virem patřícím do skupiny A:H1N1. Samotný pojem „A:H1N1“ neznačí nic nového, ale konkrétní struktura viru byla zvláštní, protože virus nesl části lidského, prasečího i ptačího původu

254 Chřipka – prevence, profylaxe, léčba
Prevence je možná očkováním, které je doporučeno hlavně oslabeným osobám. Očkování chrání jen před viry aktuálně přítomnými v populaci, nikoli před novými subtypy viru. K profylaxi a léčbě lze použít některá antivirotika, jednak inhibitory proteinu M2 (amantadin a rimantadin, některé kmeny jsou již na ně rezistentní), jednak inhibitory neuraminidázy (zanamivir a oseltamivir, známé pod firemními názvy TAMIFLU a RELENZA). Antivirotika je třeba užívat jen ve zdůvodněných případech. Zbytečné „preventivní“ užívání kvůli panice může vést vývoji rezistence.

255 Virus chřipky www.ontariogenomics.ca/education/episode6.asp

256 Chřipka – životní cyklus

257 In flew Enza  Z knihy „A practical guide to clinical bacteriology“, Pattison JR et al., Wiley, London 1995

258 Další respirační viry

259 Viry parachřipky Jsou to paramyxoviry, blízce příbuzné viru příušnic (mumps) a vzdáleněji i viru spalniček (osýpok) Na rozdíl od pravé chřipky dělají často i katary horních cest dýchacích. Chřipce podobný kašel však může být též, většinou však (zvlášť u dospělých) bez horečky. Diagnostika: KFR, HIT, ELISA; jsou zkřížené reakce. Je možný i přímý průkaz ve výplachu z.nosohltanu izolací na buněčné kultuře.

260 RS virus (respirační syncyciální virus, pneumovirus)
Je vzdáleně příbuzný virům parachřipek RS-virus je významným patogenem dolních cest dýchacích v prvním půlroce života Jak napovídá název, způsobují splývání nakažených buněk (syncycia – soubuní) Diagnostika – ELISA, přímo buněčné kultury Metapneumovirus je novější virus, který je s pneumovirem příbuzný

261 Adenoviry – Neobalené DNA viry
Poprvé byly izolovány 1953 z vyříznuté adenoidní vegetace (nosní mandle) Zahrnuje viry lidské, zvířecí a ptačí Jsou středně velké (80 nm), neobalené, symetrie kapsidy je kubická. Mají tvar dokonale pravidelného dvacetistěnu. Kapsida je složena z.240 hexonů a 12 vrcholových pentonů. Je známo 47 serotypů adenovirů, které mohou být patogenní pro člověka. Ty se mohou lišit příznaky i možností diagnostiky

262 Adenovirus

263 Lidské adenoviry Mohou vyvolávat rýmy (nádchy), záněty hltanu, záněty spojivek (od lehčích po závažné) Typy 40 a 41 (lišící se také tím, že se nedají kultivovat) způsobují průjmy (hnačky) malých dětí Jeden typ také může způsobovat zánět močového měchýře s krvácením Diagnostika může být kultivační (na buněčných kulturách) a serologická (komplementfixace) Cílená léčba není možná

264 Adenovirus

265 Adenoviry

266 Mykoplasmata

267 Mykoplasmata

268 Mykoplasmata zvláštní skupina bakterií – Mollicutes – "ty s měkkou kůží" nemají buněčnou stěnu nelze stanovit jejich tvar, který může být kulatý, oválný či vláknitý u člověka jsou významné rody Mycoplasma a Ureaplasma nejmenší organismy, které ke svému růstu nepotřebují cizí buňku několikrát menší než běžné bakterie

269

270 Mycoplasma pneumoniae
původcem tzv. atypických pneumonií. mohou nastat i mimoplicní komplikace (srdeční, nervové a jiné). často naopak jen jako rýma nebo úplně bez příznaků přenos vzduchem

271 Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum
důležití původci pohlavně přenosných nákaz záněty pochvy, močové trubice aj. na druhou stranu jsou často přítomny v uretře zdravých osob Další urogenitální mykoplasmata: Mycoplasma genitalium: také na pohlavních orgánech, význam nejasný Mycoplasma penetrans: u nemocných AIDS jako oportunní infekce

272 webdb.dmsc.moph.go.th

273 Mykoplasmata webdb.dmsc.moph.go.th

274 Mykoplasmata: diagnostika a léčba
Kultivace na nebuněčných, avšak nicméně speciálních médiích KFR, ELISA aj. Obvykle zároveň se serologií respiračních virů Nelze použít antibiotika, působící na buněčnou stěnu Účinné jsou tetracykliny, u dětí je nutno použít makrolidy (tj. erytromycin a spol.) U M. pneumoniae se zkouší očkování – ve stádiu výzkumů.

275 Virus klíšťové encefalitidy

276 Virus klíšťové encefalitidy Vírus kliešťovej encefalitídy
RNA virus, patří mezi flaviviry Klíšťová encefalitida sice postihuje často děti, závažné příznaky má však spíše u dospělých. Přesto se dospělí málokdy nechají očkovat. V.první fázi připomíná chřipku, ve druhé příznaky meningeální či mozkové. Smrtnost (letalita) infekce je 1–5 %. Jde o typický arbovirus, zdrojem jsou hlodavci Diagnostika je nejčastěji nepřímý průkaz – KFR, HIT, ELISA. Lze použít také přímý průkaz izolací viru na sajících myšatech, případně PCR

277 Virus klíšťové encefalitidy

278 Některé vlastnosti virů důležité pro diagnostiku

279 Z vlastností virů Víme již, že viry jsou nebuněčné částice, obsahující DNA či RNA v nukleokapsidě, a případně ještě obsahující virový obal Součástí tohoto obalu může být látka, která in vitro shlukuje červené krvinky. Tohoto jevu jsme ostatně už využili v praktiku J08 v.hemaglutinačně inhibičním testu. Podobná je také schopnost hemadsorpce Z dalších vlastností: Virus potřebuje cizí buňky. Takové nalezne např. ve buněčné kultuře nebo ve strukturách oplodněného vejce s kuřecím zárodkem

280 Přehled virologické diagnostiky

281 Virologická diagnostika
Přímý průkaz Mikroskopie: elektronoptická, optická jen k průkazu něčeho, co viry dělají in vivo či in vitro (inkluze, cytopatický efekt) Kultivace  izolace Vyžaduje živé buňky. Biochemická identifikace nepadá v úvahu Pokus na zvířeti zde splývá s izolací viru Průkaz DNA – u virů > u bakterií Průkaz Ag ve vzorku – velmi běžný Nepřímý průkaz – obvykle základem veškeré diagnostiky virů

282 Chřipka – diagnostika Diagnostika má epidemiologický význam (důkaz, že epidemii působí opravdu chřipka) Přímý průkaz chřipky (výplach z nosohltanu nebo výtěr do speciálního transportního média) průkazem virového antigenu izolace v amniové dutině (virus se pak prokazuje Hirstovým testem) izolace na buňkách opičích ledvin průkaz virové RNA pomocí PCR Nepřímý průkaz chřipky klasické vyšetření – párová séra, KFR, HIT ELISA – IgM, IgA

283 Mikroskopie ve virologii. Izolace virů

284 Mikroskopie ve virologii
Elektronová mikroskopie je vhodná k.pozorování většiny virů. Je však velmi nákladná a není vždy dostupná (= ne k rutinní diagnostice) Optická mikroskopie se dá použít K pozorování cytopatických efektů in vitro (řada různých virů) K pozorování buněčných inkluzí in vivo (Negriho tělíska u vztekliny) – spíše v rámci histologie než mikrobiologie K pozorování velikých virů (poxviry) – výjimečně, pro praxi se nehodí

285 Izolace virů Zvíře se používá dnes již méně často. Klasickým zvířetem je sající myše. Vaječný zárodek je klasickou metodou Amniová dutina Allantois Žloutkový vak Chorioalantoidní membrána (pouze zde někdy pozorovatelný výsledek – tzv. poky; v ostatních případech není výsledek izolace na zárodku viditelný) Buněčné kultury (kultury „nesmrtelných“ zvířecích či lidských buněk – embryonálních či nádorových): například LEP, HeLa, opičí ledviny a různé jiné. Některé (jen některé!) viry dělají na buněčné kultuře cytopatický efekt (CPE)

286 Oplodněné vejce a jeho části

287 Ještě jedno schéma oplodněného vejce
SH – skořápková (papírová) membrána AB – bílek AM – amniový vak, YS – žloutkový vak, AL – allantois CH – chorioallantoidní membrána (CAM)

288 Izolace virů a podobných agens na vejci
Amniová dutina, obklopující zárodek se používá často, např. u virů chřipky Allantois, tedy odpadní váček, je zejména u starších embryí snadno dosažitelnou strukturou. Je však málo výživný Žloutkový vak slouží např. k pěstování chlamydií (což jsou bakterie, ale vlastnostmi značně podobné virům) Chorioalantoidní membrána slouží k.pěstování zejména poxvirů a herpesvirů Při výrobě očkovací látky se virus pěstuje na allantois (což je možné až po několika pasážích v amniu)

289 Izolace viru na oplodněném vejci prakticky Ovoskop
V době, kdy svět přetéká technicky komplikovanými přístroji, kterými rozumí stále méně techniků, zůstává úžasným klasickým zařízením ovoskop. Skládá se z.dřevěné bedničky, žárovky a posuvného prkénka s dvěma otvory. Jeden je kulatý k umístění vejce nastojato Druhý je oválný k umístění vejce naležato

290 Aplikace viru do amniové dutiny: jak to provést
Vejce prosviťte v ovoskopu a naznačte tužkou okraj vzduchové bubliny Odřízněte skořápku nad vzduchovou bublinou Na papírovou blanku kápněte alkohol Vejce opět prosviťte v ovoskopu a vyznačte pozici zárodku, resp. jeho oka Jehlou se jakoby snažte vypíchnout oko kuřecímu zárodku (ono stejně uteče) – buď přímo v.ovoskopu, nebo případně mimo něj Aplikujte virus Vejce opět zavíčkujte a inkubujte několik týdnů

291 Jak prokážu virus, když ho není nijak vidět?
Bakterie při kultivaci tvoří viditelné kolonie, nebo aspoň kalí bujón. Naproti tomu, jen někdy vidíme výsledek izolace viru (CPE, poky), mnohem častěji výsledek viditelný není Izolovaný virus tedy musíme nějak prokázat U virů z amniové tekutiny se používá Hirstův test – průkaz schopnosti viru shlukovat krvinky. V případě pozitivity se zjišťuje, které specifické protilátky jsou schopny shlukování zabránit (jde tedy o HIT použitý zde k přímému průkazu) U virů z buněčných kultur (např. viru chřipky z kultury opičích ledvin) se testuje schopnost virové hemadsorpce

292 Hirstův test prakticky
F = fyziolog. roztok V = virus (amniová tekutina) E = erytrocyty 0.2 ml F ----- 0.2 ml V 0.2 ml míchej pipetuj 0.2 ml E do desinfekce

293 Cytopatický efekt (CPE) na buněčné kultuře
Jen zřídka se cytopatický efekt viru na buňku projeví podstatnou změnou metabolismu, která by se pak při přidání indikátoru projevila barevnou změnou viditelnou makroskopicky (jak bychom viděli u virus neutralizačního testu) Častěji CPE pozorujeme v mikroskopu: zakulacení buněk ztráta desmosomů mezi buňkami ztráta uspořádání jedním směrem celkově nastává „místo řádu chaos“ Mnohé viry ovšem na buněčných kulturách nedělají vůbec žádný cytopatický efekt

294 Tento obrázek ještě uvidíte jednou…
Tento obrázek ještě uvidíte jednou… (HSV je virus prostého oparu – HSV 1 způsobuje zpravidla herpes labialis, HSV 2 herpes genitalis)

295 Praktické pozorování buněčných kultur
Strčte si do mikroskopu celé zkumavky tak jak jsou, snažte se zaostřit na vnitřní stěnu. Možná uvidíte buněčné kultury, v některých možná i s.cytopatickým efektem Zkušené oko rozezná různé buněčné kultury a případně také různé typy cytopatických efektů

296 Takže tady CPE je… …kdežto zde není
(HSV je virus prostého oparu – HSV 1 způsobuje zpravidla herpes labialis, HSV 2 herpes genitalis)

297 Techniky shell-vials Jde o techniky urychlené kultivace.
Inokulum se centrifugací vmasíruje do buněčné kultury narostlé na kulatém krycím sklíčku Pomnožený virus se dokazuje pomocí imunofluorescence monoklonálními protilátkami Celý postup je hotov do 24 h po přijetí vzorku (zatímco klasická kultivace trvá několik týdnů)

298 Nepřímé metody ve virologii

299 KFR u respiračních virů – příklad
Cílem je určit, který z šesti testovaných původců je zodpovědný za momentální respirační potíže našeho pacienta Pozitivní je nepřítomnost hemolýzy (=  sedimentace krvinek na dno) Negativní je hemolýza („malinová limonáda“) Titr je nejvyšší ředění, kde je ještě reakce pozitivní (= kde krvinky sedají na dno) Čtyřnásobný vzestup/pokles titru se považuje za signifikantní (při použití párových sér)

300 HIT – klíšťová encefalitida (příklad)
Vedle KFR je HIT jednou z klasických metod průkazu tohoto viru. Pozitivní je zábrana virového shlukování krvinek (= sedimentace krvinek na dno) Negativní je shlukování krvinek (bramboroid či bramborák, jak je komu libo) Titr je nejvyšší ředění, kde je ještě reakce pozitivní (tedy kde krvinky sedají na dno) Čtyřnásobný vzestup/pokles titru se považuje za signifikantní při použití párových sér

301 Konec

302 Kontrolní otázky 1. Jak se ve virologii používá elektronová a optická mikroskopie? 2. Co znamenají termíny „buněčná kultura“ a „cytopatický efekt“? 3. Které části oplodněného vejce se využívají k pěstování virů? 4. Proč se v diagnostice virů někdy užívají pokusná zvířata? 5. Jaké vzorky a metody se používají při virologické diagnostice chřipky? 6. Které metody průkazu virů vyžadují odběr dvou vzorků a jaký je ideální odstup mezi prvním a druhým odběrem? 7. Na čem jsou založeny techniky shells-vials? 8. Které jsou typické metody nepřímého průkazu virů? 9. Co je zač Mycoplasma pneumoniae? 10. Co znamená zkratka „RS virus“?