Látkové složení.

Prezentace na téma: "Látkové složení."— Transkript prezentace:

1

2

3

4

5

6

7

8 Látkové složení

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27 Esenciální AMK Rostliny + mikroorganismy 0 Člověk – biosyntéza -12
esenciální - 8 Lys, Try, Phe, Met, Thr, Ile, Leu, Val, Arg?

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40 Titrační křivka

41

42

43 Thalidomid

44 Thalidomid

45

46

47 L AMK - CO-R-N

48

49 Diastomery threoninu

50

51 Ninhydrinová reakce

52

53 RP HPLC AMK

54

55

56

57

58

59 Proinzulín 84 AMK

60 Inzulín – 51 AMK

61

62 Amanita phalloides

63

64 Microcystiny

65 Microcystiny

66

67

68

69

70

71

72 Srpkovitá anémie

73 Srpkovitá anémie

74

75

76

77

78 MS

79 MS-MS

80 MS-MS

81 MS-MS

82

83

84

85

86

87 Trans Cis

88

89

90

91

92 α - helix

93 β - sheet

94 β - turn

95

96

97

98 Strukturní motivy

99 Strukturní domény

100

101

102

103 Hemoglobin

104

105 Rtg difrakce

106 Denaturace - renaturace

107

108

109 Chaperony

110 Titrační křivka

111

112

113 Izolace proteinů

114 Literatura Scopes : Protein Purification
Harris : Protein Purification Methods – Practical Approach Deutcher : Guide to Protein Purification Janson : Protein Purification Kastner : Protein Liqiud Chromatography

115 Metody separace proteinů
Vychází z klasických metod chemické analýzy Uplatňují se zde i speciální metody

116 Problémy se vzorkem Komplexnost Malá množství Labilita

117 Plánování separace bílkovin

118 Cíl izolace Získání homogenní bílkoviny Zachování biologické aktivity
Čistota Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného úsilí

119 Volba vstupního materiálu
Preparát z daného organismu Preparát s největším obsahem dané bílkoviny Preparát s nejmenším obsahem nečistot

120 Sledování průběhu separace
Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita Přečištění Výtěžek extrakt 100 1 - 100 % HIC 50 99 1.99 99 % IEX 25 75 3 1.5 75 %

121 Stanovení koncentrace bílkoviny

122 Kjeldahlova metoda – stanovení N2
Mineralizace vzorku – převedení organického dusíku na NH4+ Stanovení NH4+ - titrace, fotometrie, selektivní elektrody

123 UV spektrofotometrie 280 nm – aromatické AMK interference nukleotidů
nm – peptidická vazba Výhody - nedestruktivní metoda - není třeba kalibrace

124 VIS spektrofotometrie
Přídavek činidla  barevný derivát Destruktivní metoda Nutná kalibrační závislost

125 Biuretová metoda Princip : Cu2+ vytváří v alkalickém prostředí
komplex se 4 N peptidické vazby Cu2+ Měření : 540 – 560 nm 310 nm

126 Folinova metoda Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany na molybdenovou modř Měření : 725 nm

127 Lowryho metoda Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody
Měření : 600 nm

128 Metoda dle Bradfordové
Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm

129 Nejčastěji používané metody
Metoda Rozsah (ng) Poznámka Biuretová okamžitý vývoj Lowryho pomalý vývoj UV nm interference UV – 205 nm Bradfordové sorpce barviva

130 Stanovení biologické aktivity
Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální receptorové atdf.

131 Vlastní separace

132 Obecné schéma Získání vstupního materiálu Rozrušení buněk Separace

133 Vstupní materiál

134 Bakterie, kvasinky, plísně, řasy
Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné množství - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - termofilní organismy

135 Bezobratlí Hmyz, plži, mlži Nevýhody - málo se používá, nesnadno se
získává

136 Živočišné tkáně Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci
Jateční zvířata – orgány Člověk – tělní tekutiny

137 Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách Nevýhoda – problematický růst za
definovaných podmínek

138 Rozbití a extrakce

139 Bakterie Záleží na lokalizaci cytoplasma periplasma

140 Balotina Princip – jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchámy – nutno chladit

141 French (X) press Princip – zmražená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk

142 Ultrazvuk Princip – ultrazvuk (> 20 kHz) v roztoku vyvolává střižní síly – nutno chladit

143 Lysozym + osmotický šok (mírný osmotický šok)
Princip – lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H2O – bakterie popraskají

144 Živočišné tkáně Třecí miska s pískem Ruční homogenizatory – Potter –
Elvehjemův Mixery Osmotická lyse - erytrocyty

145 Rostlinné tkáně Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas,
Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony – melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny

146 Srážecí metody

147 Srážení Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH4)2SO4 Filtrace nahrazena centrifugací

148 Rozpustnost bílkoviny
Vlastnostmi bílkoviny – distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny + - + - +

149 Rozpustnost bílkoviny
Vlastnostmi roztoku – pH, iontová síla, org. rozpouštědla, org. polymery, teplota

150 Izoelektrická precipitace
+ - + - pI - +

151 Srážení neutrálními solemi
vsolování vysolování

152 Vsolování - + H2O

153 Vysolování

154 (NH4)2SO4 Rozpustnost se málo mění s teplotou
Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3) Levný Stabilizuje bílkoviny Relativně čistý

155 Srážení - dvojstupňově

156 Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou
Rozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny - + H2O

157 Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou
COHN – separace plazmatických bílkovin EtOH Nutno provádět při T < 0 oC, při větší teplotě dochází k denaturaci Dvojstupňově Přídavky z tabulky nebo podle vzorce

158 Srážení selektivní denaturací
Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z % v nativním stavu. Denaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla Bílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat

159 Tepelná denaturace

160 Chromatografické metody

161 Chromatografie Cvet – separace chlorofylů na Al2O

162 Chromatografie

163 Zařízení pro LPC

164 Ionexová chromatografie
elektrostatická interakce Vazba + Eluce + +

165 Ionexy Katexy - - vazba kationtů
silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO3- slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) COO- Anexy - + vazba aniontů silné - dietylaminoetyl(DEAE) slabé – trietylaminoetyl(TEAE)

166 Ionexová chromatografie
Nanášení vzorku – nízká iontová síla Eluce – gradientová Zvyšováním iontové síly Změnou pH Afinitní eluce Použití – purifikace, zakoncentrování, výměna pufru

167 Hydrofobní chromatografie
Stacionární fáze – - C8, -fenyl Mobilní fáze – vodné roztoky 1.7 M (NH4)2SO4 Eluce – snižováním iontové síly Použití : purifikace bílkovin

168 Afinitní chromatografie

169 Afinitní páry

170 Afinitní chromatografie nanesení vzorku

171 Afinitní chromatografie vznik interakce

172 Afinitní chromatografie vymytí balastů

173 Afinitní chromatografie eluce

174 Provedení Nanesení vzorku – nízká iontová síla
Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity Použítí : analytické (stanovení K), purifikace

175 Gelová permeační chromatografie

176 Gelová permeační chromatografie
Princip - stérická exkluse - omezená difuse Pořadí eluce : MrA>MrB>MrC

177 Gelová permeační chromatografie
Totální exkluse Selektivní permeace Totální permeace

178 Gelová permeační chromatografie
Nanášení vzorku – objem vzorku < 2% objemu kolony Eluce – izokratická Použití : stanovení Mr, odsolování, purifikace

179 Elektromigrační metody

180 „Pohyb elektricky nabitých částic
Podstata „Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli“

181 Zónová elektroforéza + + A+B+C A B C - A > B >C

182 Upořádání Horizontální + -

183 Upořádání Vertikální + -

184 Polyakrylamid Složení – kopolymer akrylamidu a
N,N,- methylenbisakrylamidu + plně splňuje požadavky Monomery jsou neurotoxiny !!!!!! Použití : analýza bílkovin

185 Polyakrylamid

186 uniformní náboj na jednotku MW
SDS PAGE + 1 g bílkoviny váže 1.4 g SDS  uniformní náboj na jednotku MW

187 SDS PAGE

188 Stanovení Mr pomocí SDS PAGE
Rm

189 Stanovení Mr pomocí SDS PAGE - standardy

190 Izoelektrická fokusace
„Elektroforéza v gradientu pH, částice jsou separováný podle svých pI“

191 Izoelektrická fokusace
+ - H3O+ OH- A pI t0 t1 pH

192 Izoelektrická fokusace
+ tx - pH H3O+ OH-

193 Izoelektrická fokusace analytická
Provedení - v gelech – PAGE, agarosa Použití - sledování komplexních směsí - izoenzymové složení - stanovení pI – rozřezání a eluce – pH elektrody – pI standardy

194 Izoelektrická fokusace analytická

195 Dvojrozměrná elektroforéza
pI 3.0 pH Mr 10.0 I.rozměr IEF II.rozměr SDS-PAGE

196 Dvojrozměrná elektroforéza
pI Mr

197

198

199

200

201

202

203

204

205

206

207

208

209 Kolagen v kůži

210 α - keratin

211 α – keratin - vlas

212 β - keratin

213 β - keratin