4. CENTRIFUGACE Podmínka dělení: l ≥ 1 suspenze  emulze

Prezentace na téma: "4. CENTRIFUGACE Podmínka dělení: l ≥ 1 suspenze  emulze"— Transkript prezentace:

1 4. CENTRIFUGACE Podmínka dělení: l ≥ 1 suspenze  emulze
 koloidní roztoky (NK, bílkoviny)

2 Rychlost sedimentující částice v
Frikční koeficient Stokesův zákon Relativní odstředivé zrychlení R – násobek g N = r.p.m. sedimentační koef. S[sec] x sedimentační konst. →Extrapolace na C0 →20o C →H2O

3 Svedbergova jednotka 1S=1x10-13 sec

4 4.1. METODY 4.1.1. DIFERENCIÁLNÍ CENTRIFUGACE metoda pohyblivého rozhraní
Dělení podle S Podmínka : ΔS max.; Smax na dno (≈ t, N) Výhody: Jednoduché Nevýhody: Pouze 1 složka STĚNOVÝ EFEKT – nedokonalé dělení

5 4.1.2. CENTRIFUGACE V KONCENTRAČNÍM GRADIENTU ZONÁLNÍ
Kontinuální Diskontinuální Sacharosa Dextran FICOL ρ ≥ 1,3 g/cm3

6 4. 1. 2. ZONÁLNÍ CENTRIFUGACE a. RYCHLOSTNÍ b. IZOPYKNICKÁ c
ZONÁLNÍ CENTRIFUGACE a. RYCHLOSTNÍ b. IZOPYKNICKÁ c. IZOPYKNICKÁ ROVNOVÁŽNÁ- automatické vytváření gradientu ( CsCl ρ≤1,9; F3AcOCs ρ≤2,6 g/cm3 ) a. RYCHLOSTNÍ b. IZOPYKNICKÁ Výhody Dokonalejší dělení Nevýhody Malé množství Separace zón obtížná (propíchnutí) Stěnový efekt ρ < ρč S ≈ r2 ρ > ρč ρ

7 Centrifugační zkumavky
Skleněné Z umělé hmoty: Ependorfky Zkumavky s víčkem QUICK – SEAL polyallomer tubes

8 4.2. TYPY ODSTŘEDIVEK

9 4.2.1. DISKONTINUÁLNÍ ODSTŘEDIVKY
s výměnným rotorem a. Se závěsnými kyvetami α = 90o V = 30 ml – 3 l, N = 3 – S úhlovým rotorem b. α = o c. α = 0o N =33 000 Výhody: Nevýhody: Krátká dráha Zvíření Úzká zóna

10 Výměnné rotory Beckman

11

12

13

14 d. se zonálním rotorem Postup Jádro rotoru s přívody Jádro s rameny
Stěna rotoru Vrotoru = 0,6 – 1,6 l Vvzorku = 20 – 200 ml 4. Gradient hustoty 5.Podložní roztok – cushion 6.Překrývající roztok – overlay Postup Plnění N = 103 ot/min Dělení centrifugací N = 104 ot/min 3. Vytlačování N = 103 ot/min

15 Čištění transformační DNA z b.subtilis centrifugací v zonálním rotoru
27 mg surové DNA/15 ml Gradient sacharosy 5-30% Citrátový pufr pH 7,0 Cushion – 50 ml 42% sach. Overlay – 100 ml pufru Plnění ot/min Dělení – ot/min 7 hod Jímané frakce 10 ml Bílkoviny + RNA DNA agregáty DNA 2,5 S S

16 4.2.2. KONTINUÁLNÍ ODSTŘEDIVKY
Typ SHARPLES N = ot./min Výhoda: Velká kapacita 20 – 50 l/hod. Suspenze i emulze Průmyslové kaly

17 4.3. POUŽITÍ CENTRIFUGACE Separace (čištění) průmyslové kaly, emulze,
Centrifugace – nejčastější metoda, nejdůležitější Separace (čištění) průmyslové kaly, emulze,  bílkoviny, NK, organely, buňky, viry, Diferenciální – počátek separace, zpracování homogenátů tkání, náhrada FILTRACE Zonální – dokonalejší, frakcionace Analýza - M

18 )

19 4.4. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGACE
20.léta Svedberg a j.: důkaz – makromolekuly ne agregáty, ale spojeny kovalentními vazbami  rozvoj chemie makromolekul 1958 Mathew MESSELSON + Franklin STAHL: důkaz semikonzervativní replikace DNA  rozvoj molekulární biologie Expanze a útlum AU Vzkříšení v 90. letech: kombinace moderních přístrojů a počítačového softwaru pro zpracování dat AU SV – sedimentační rychlost: S a hydrodynamické vlastnosti SE – sedimentační rovnováha: M, Kasociace

20 Důkaz semikonzervativní replikace DNA
1958 Mathew MESSELSON + Franklin STAHL

21 4.4.2. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGA

22 Analytická centrifuga BECKMAN –COULTER XL-I
rpm T = ºC Detekce→ UV, VL absorpce, interference index lomu  Detekce neabsorbujících biomakromolekul (sacharidy) Detekce změn konformace nebo asociace bílkovin vlivem ligandů nebo léčiv Vhodnější pro SV celých buněk – rychlejší akumulace dat

23 4.4.3. ANALYTICKÁ CENTRIFUGA - DETEKCE
Šlíry (index lomu) Interference Fotografická absorbance (Schachman 1959) Fotoelektrická absorbance- současný optický systém

24 Kyveta pro AU Dráha – 1,5 cm Obsah μl c - 0,1mg/ml

25 Metoda pohyblivého rozhraní - SV

26 4.4.4. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGACE -VYUŽITÍ
Stanovení M Bez kalibrace (x GPC a ElFo) Široký rozsah: 102 (sacharosa, AA) – 106 (viry, organely) !!! Malé množství (20 – 120 μl) i c (0, 01 – 1 g/l), i vysoká c Stanovení homogenity rychlé, kvantitativní určení distribuce částic, stupeň agregace volně v roztoku, nativní, bez případné interakce s matricí Analýza asociujících systémů – široký rozsah: interakcí jak existují v roztoku (makromolekuly s ionty a malými, solvatace, agregace) M c K (10 – 100 M-1 ) Určení pravděpodobného tvaru (koule x cylinder) Detekce konformačních změn ?

27 4.4.5. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGACE - ZÁVĚR
AU je všestranná, přesná metoda pro studium biomakromolekul v roztoku při vybrané T M a S Kasociace Solvatace, agregace Heterogenita roztoku Tvar, změny konformace