Světelný mikroskop - základní pracovní nástroj

Prezentace na téma: "Světelný mikroskop - základní pracovní nástroj"— Transkript prezentace:

1 Světelný mikroskop - základní pracovní nástroj
Tři cíle mikroskopie: zvětšit obraz rozlišit detaily v obraze popsat detaily viditelné okem nebo kamerou Jednoduchý mikroskop jedna čočka nebo jeden systém čoček (lupa) Složený mikroskop více čoček nebo více systémů čoček

2 Světelná mikroskopie a kontrastní metody
Historie světelného mikroskopu To, že sklo ohýbá procházející světlo, je známo více než 2000 let, ale první skutečné čočky byly vyrobeny až kolem roku Kolem roku 1600 byly vyrobeny optické přístroje s několika čočkami Odjakživa chtěli lidé vidět věci mnohem menší, než mohli vnímat pouhým okem

3 Hans a Zacharias Janssenovi
První složený mikroskop (kolem 1595) zvětšoval 3x při zatažení tubusu a více než 10x při max. roztažení, měřil 1,2 m nejstarší známá kresba mikroskopu Už na počátku novověku, kdy již kvetlo brýlařské řemeslo, bylo na spadnutí, zda někoho napadne složit dvě čočky dohromady. Konečně kolem roku 1590 dva holandští výrobci brýlí - otec Jan a syn Zacharias Janssenové - vynalezli zvětšovací přístroj, sestávající z trubice se dvěma čočkami na koncích. Ačkoli mikroskop měl pak několik dalších zlepšovatelů a propagátorů, učenci vytrvale desítky let ke svému bádání používali obyčejnou lupu.

4 Antony van Leeuwenhoek
( ) Jednoduchý mikroskop(1660) Konvexní skleněná čočka byla připevněna do kovového držáku a byla zaostřována pomocí šroubu. čočka zaostřovací šroub držák vzorku Ale byl to v 60. letech 17. století holandský obchodník s plátnem Antony van Leeuwenhoek, který jako první zhotovil a používal opravdový mikroskop. Vybrousil malou skleněnou kouli jako čočku se zvětšením až 270x a použil ji pro práci s prvním jednoduchým mikroskopem. Mikroskop vůbec neznal a musel jej sám objevit. Jako mladík prý jednou našem mezi haraburdím svého otce (vetešníka) skleněný střípek. Než jej vyhodil, položil ho náhodou na kousek látky. Kdyby šlo o dokonale rovný střep, nic moc by se nestalo. Kvůli nedokonalé výrobě byla však skla vždy více či méně zvlněná. Leeuwenhoek si všiml, že struktura tkaniva vypadá pod střepem docela jinak než při pozorování pouhým okem. Samozřejmě studoval kvalitu zboží, ale třeba také plísně na mase, vlastní krev nebo sperma. Při pozorování vodní kapky Leeuwenhoek objevil spoustu "proklatých malých potvůrek". Jako první člověk na světě tak viděl mikroby. Své objevy začal popisovat a posílat Královské společnosti v Londýně. Učenci mu ale nevěřili.

5 Robert Hook 1665 složený mikroskop kniha Micrographia,
sledování tenkých řezů korkem - pojem buňka Když jim ale jejich kolega Robert Hooke přinesl svůj mikroskop a oni uviděli totéž, co popisoval Leeuwenhoek, uvěřili mu. Z pláteníka se stal zahraniční člen Královské společnosti a světoznámá osobnost. Zarputile však odmítal opustit rodnou hroudu a už vůbec nehodlal některý ze svých mikroskopů dát z ruky. A tak se podívat do "zázračných" přístrojů přišli k němu domů i ruský car a anglická královna. Když Leeuwenhoek roku 1723 v 91 letech zemřel, zbylo po něm 419 mikroskopů, z nichž některé zvětšovaly až 270krát. Vynález složeného mikroskop přispěl k obrovskému rozvoji vědy. Právě Angličan Robert Hook pomocí svého složeného mikroskopu, u kterého k osvětlení objektu použil olejovou lampu a tzv. ševcovskou kouli objevil, že živé organismy jsou složeny z buněk. Ševcovská koule je naplněná buď vodou nebo lépe roztokem síranu měďnatoamonného, který pohlcuje žluté paprsky a propouští paprsky bílé.

6 Mikroskopy 17. století Anglie Itálie Galileo Galilei
John Yarwell, 1680 Itálie Guiseppe Campani,1662 Galileo Galilei po roku 1600 Jednoduchý Italský mikroskop, 1686 1.Tripodický mikroskop ze dřeva - Lignum vitae (Guaiacum officinale), lepenky a kůže vykládané zlatem 2. mikroskop ze slonoviny, Itálie 3. Jednoduchý Italský mikroskop ze dřeva Lignum vitae, objekty byly připevněny na dřevěném disku ned kterým byla čočka 3. mosazný mikroskop zhotovil Galileo Galilei

7 Mikroskopy 18. století 1700 1730 1761 1730 kolem r.1700 1761 Kostěný bezejmenný „bleší“ mikroskop - stále přetrvávají jednoduché mikroskopy(kolem 1700) Culpeperův mikroskop (Anglie)- složený, trojnožky z mosazi, dvě zrcátka, dřevo, chráněn měkkou kůží (1730) Na požádání krále Jiřího III zhotovil Georg Adams stříbrný mikroskop s ornamenty

8 Mikroskopy 19. století 1826 1865 1899 The first part of the nineteenth century witnessed dramatic improvements in optics with the introduction of achromatic objectives by van Deijl, Amici, and Lister. Advanced glass formulations by Zeiss, Schott, and Abbe helped produce the first apochromat objectives. Photomicrography made its debut in mid-century, and Professor August Köhler introduced a method of illumination, which he developed to optimize image quality, allowing microscopists to take full advantage of the resolving power of Abbe's objectives. Prví polovina 19. Století byla svědkem dramatického zdokonalení v optice s uvedením achomatických objektivů van Deijla, Amici a Listera. Pokrok vytváření skla Zeisem Schottem a Abbem pomohl vytvořit první apochromatické objektivy. V polovině století měla svůj debut mikrofotografie a prof. Köhler uvedl metodu osvětlení, když vyvinul optimální kvalitu obrazu, takže mikroskopie dala plnou přednost rozlišovací schopnosti Abbého objektivů. A revolutionary compound microscope that was one of the first to sport lenses corrected for achromatic aberration Built at the end of the American Civil War, this single-lens microscope was useful for dissecting very small specimens. 1899One of the most advanced stereomicroscopes of the period, this Leitz binocular microscope served well as a routine laboratory workhorse.

9 Mikroskopy 20.století Nikkon 1900 Leitz 1910 Olympus 1998
This simple brass and enamel compound monocular microscope is the forefather of a grand line of microscopes that rank among today's most sophisticated optical instruments. This unique marriage of early twentieth century microscopy and photographic technology was very advanced for the period. This high-end microscope from Olympus is considered to be the latest state- of-the-art in microscope design and construction.

10 Lupa Mikroskop Skládá se z jedné čočky nebo z jediného systému čoček
Složitý přístroj, který umožňuje velké zvětšení mikroskopických objektů a má odstraněné vady čoček (vyklenutí zorného pole, astigmatická vada,…) Olympus CX31 Složení mikroskopu 1. Část mechanická: stativ, noha stativu, tubus, revolverový měnič objektivů, stolek, makrošroub, mikrošroub 2. Část osvětlovací: zdroj světla, zrcátko, polní clona, kondenzor, irisová clona, objímka filtru 3. Část optická: objektivy, okuláry

11 1. Část mechanická Stativ Noha stativu
Tubus - spojuje okulár a objektiv Mechanická (optická) délka tubusu - vzdálenost mezi horním a dolním koncem tubusu, mění se vzájemným posunem dvou na sebe nasunutých částí, dána výrobcem ( mm) a je nutno ji dodržovat - objektivy a okuláry konstrukčně přizpůsobeny - nekonečná délka tubusu (vkládání modulů),  - monokulární přímý, šikmý, binokulární, trinokulární Revolverový měnič objektivů Stolek - pohyblivý; s křížovým vodičem preparátu, který se ovládá dvěma šrouby Makrošroub - pro hrubé ostření Mikrošroub - pro jemné doostřování Úkolem objektivu je vytvořit zvětšený, skutečný a převrácený obraz předmětu (který se klade za jeho předmětové ohnisko) ve vzdálenosti D od obrazového ohniska. Úkolem okuláru je pak umožnit pozorování tohoto obrazu neakomodovaným okem. Předmětové ohnisko okuláru musí být tedy vzdáleno od od obrazového ohniska objektivu o D . Nastavení této vzájemné polohy objektivu a okuláru zajišťuje tubus. Veličina D se nazývá optickou délkou /intervalem) mikroskopu.

12 2. Část osvětlovací Pozorujeme ve světle procházejícím (světlo prochází pozorovaným objektem) a méně často dopadajícím (světlo dopadá shora na povrch objektu) Zdroj světla - lampa v noze stativu s kolektorovou čočkou (fixně seřízená), kolektor spolu se zrcátkem soustřeďuje světlo do kondenzoru Polní clona - používá se při malém zvětšení, viz práce s mikroskopem Kondenzor - skládá se ze 2-3 spojených čoček (spojek), nasazených do objímky pod stolkem mikroskopu; soustřeďuje paprsky pro dokonalé osvětlení zorného pole Numerická apertura kondenzoru má odpovídat numerické apertuře objektivu (70-80%). (Numerickou aperturu kondenzoru určuje irisová (aperturní) clona - viz práce s mikroskopem) Irisová clona - reguluje množství světla přicházejícího do mikroskopu; zasazena do spodního okraje pouzdra kondenzoru Objímka filtru - používá se matný nebo modrý filtr

13 3. Část optická - čočky Zabezpečuje vhodnou kombinací čoček (kromě vytváření obrazu) také v různé míře odstraňování hlavních optických vad čoček ČOČKY Průhledné těleso omezené vypuklými (konvexními) a vydutými (konkávními) plochami Z funkčního hlediska rozlišujeme: spojky a rozptylky Optická osa (prochází středem čočky - O) a 2 ohniska (obrazové F - vzniká v něm obraz; předmětové F´- na straně předmětu) Středem čočky proložíme hlavní rovinu a vzdálenost ohniska od hlavní roviny se nazývá ohniskovou vzdáleností (f) F F´ f O

14 3. Část optická - čočky Geometrické zobrazování spojnou čočkou (viz obr.) - paprsek rovnoběžný s optickou osou se na povrchu čočky láme do F; paprsek procházející středem čočky se neláme; paprsek procházející F´ se láme rovnoběžně s optickou osou Zobrazování předmětu mikroskopem: preparát umístěn mezi dvojnásobnou ohniskovou vzdálenost a ohnisko objektivu - skutečný, zvětšený, převrácený obraz Hlavní vady čoček: Vada barevná (chromatická) - způsobená různým lomem světla o různé vlnové délce odstranění pomocí soustavy dalších čoček (achromáty) Vada kulová (sférická) - vzniká tím, že paprsky rovnoběžné s osou se lámou různě podle jejich vzdálenosti od středu čočky Vada astigmatická - paprsky dopadající na čočku ze strany se neprotnou v jednom bodě Vyklenutí zorného pole - paprsky dopadající na čočku šikmo mají jiné ohnisko než rovnoběžné paprsky přímé; nelze zaostřit na celé zorné pole F F´

15 3. Část optická - objektiv
Vytváří zvětšený převrácený a skutečný obraz předmětu Čím je kratší ohnisková vzdálenost objektivu, tím je větší zvětšení. Zvětšení objektivu - je vyznačeno (10x, 20x, 30x); dá se vypočítat z ohniskové vzdálenosti podle vzorce Z = 250 / f mm je tzv. normální zraková délka Numerická apertura (A) - vyjadřuje vztah mezi otvorovým úhlem (úhel, který svírají dva nejkrajnější paprsky, které se ještě dostanou do otvoru objektivu) a lomivostí prostředí objektiv A = N * sin α/2 α - otvorový úhel α N - index lomu prostředí mezi objektivem a preparátem preparát

16 3. Část optická - objektiv
Čím je větší numerická apertura, - tím je vyšší rozlišovací schopnost objektivu (schopnost rozlišit dva vedle sebe ležící body jako samostatné). - tím menší hloubková ostrost (schopnost současně ostře zobrazit větší nebo menší počet rovinných vrstev předmětu). Světelnost objektivu je přímo úměrná A2 Krycí sklíčko N=1,51, vzdušné prostředí N= úhly (menší ve skle, větší ve vzduchu), pod nímž vstupují paprsky do objektivu do objektivu se dostane menší množství paprsků (použití imerzního oleje N=1,5) Pozorovací (pracovní) vzdálenost - vzdálenost čelní čočky objektivu od krycího skla preparátu Velikost zorného pole - větší, čím menší zvětšení objektiv má (čím větší f, tím větší zorné pole) Světelnost objektivu - intenzita osvětlení zorného pole, závislá na numerické apertuře (viz výše)

17 3. Část optická - objektiv
Typy objektivů Achromáty - jednoduché, složené ze 2 až 6 čoček; je u nich korigovaná chromatická vada, a to pro žlutou až zelenou oblast spektra Apochromáty - korekce barevné vady pro tři základní barvy spektra, vyšší numerická apertura a lepší rozlišení detailů Planachromáty - barevně korigovány jako achromáty a korigováno i vyklenutí zorného pole (mikrofotografie) Planapochromáty - zcela odstraněno vyklenutí zorného pole i chromatická vada, patří k nejlepším a nejdražším objektivům Fluoritové objektivy - z fluoritového skla (vynikající optické vlastnosti), dobře propouští UV záření, vhodné pro fluorescenci ale i pro pozorování ve světlém poli

18 3. Část optická - objektiv
Suché objektivy- mezi objektivem a krycím sklem vzduch Imerzní objektivy - imerzní olej - vodní imerze Objektivy pro práci bez krycího skla - NCG (no cover glass)-hematologie Objektivy s korekcí na tloušťku krycího skla - korekční prstenec Objektivy s irisovou clonou - omezení světelného toku objektivem, vliv na hloubku ostrosti Odpružené objektivy - zamezení mechanickému doteku čočky Objektivy pro speciální pracovní postupy - např. fázový kontrast, DIC Barevné označení objektivů - červená,žlutá, zelená,světle modrá, tmavě modrá, černá

19 3. Část optická - okulár Zvětšuje obraz vytvořený objektivem.
Zvětšení okuláru je prázdné - nezobrazuje více detailů, než bylo zobrazeno objektivem Typy okulárů Huygensův okulár H - skládá se ze 2 čoček, v kombinaci se slabými objektivy (achromáty) Ortoskopické okuláry O - nezkreslují zorné pole, v kombinaci s objektivy achromatickými a planachromatickými Kompenzační okuláry K - kompenzují chromatickou vadu objektivů, jsou určeny pro práci s apochromáty Periplanatické okuláry P - kompenzují chromatické vady a částečně i vyklenutí zorného pole, v kombinaci s planachromatickými objektivy Brill okuláry - umožňují pozorování a kompenzaci pro dioptrické oko, dioptrická korekce, manžety Širokoúhlé okuláry - průměr zorného pole až 25 mm Projektivy - okulár používaný při mikrofotografii

20 Postup práce s mikroskopem 1
1. Mikroskop přenášíme oběma rukama (kapotáž), manipulujeme pouze pomocí vroubkovaných částí 2. Zapneme mikroskop, vložíme preparát 3. Nastavíme vzdálenost okulárů a provedeme dioptrickou korekci (okulár bez dioptru zaostříme na objekt mikrošroubem, zavřeme oko; okulár s dioptrem doostříme podle svého oka). Použití manžet: při pozorování s brýlemi ponechte manžety ohrnuté, nikdy manžety neodstraňovat z hygienických důvodů !!!!!!!! 4. Nastavíme slabší objektiv a makrošroubem přiblížíme k preparátu. Doostříme mikrošroubem.

21 Postup práce s mikroskopem 2
5. Centrování polní clony dle Köhlera: mějte objektiv o zvětšení 10x a zaostřete na preparát. - uzavřete téměř polní clonu - otáčejte kolečkem nastavení výšky kondenzoru, dokud v zorném poli zřetelně neuvidíte obraz polní clony - otáčením centrovacích šroubů kondenzoru přesuňte obraz otvoru polní clony doprostřed zorného pole - správné vycentrování clony ověříte otevřením clony tak, aby se okraje obrazu jejího otvoru dotýkaly okrajů zorného pole - pře dalším pozorováním otevřete polní clonu tak, aby obraz jejího obvodu byl opsán zornému poli 6. Zaostřený obraz prohlížíme nejprve při malém zvětšení, detaily při větším zvětšení. 7. U mikroskopu Olympus CX31 není nutné při výměně objektivů upravovat intenzitu spodního osvětlení posunem kondenzoru.Nastavíme správnou aperturní clonu (podle čísla na objektivu, hodnota na stupnici by měla odpovídat 80% numerické apertury objektivu).

22 Potřeby pro mikroskopování
Krycí skla -různá tloušťka (0,08; 0,11; 0,13;0,17;0,20 mm) - velikost (mm) a tvar Podložní skla - různá tloušťka (1; 1,2 mm) velikost (26 x 70 mm) - zabroušené hrany, matované Preparační soustavy - pinzeta, skalpel, nůžky, preparační jehly, štětec, pipeta Laboratorní sklo - Petriho miska, hodinové sklo, kádinka atd. Krabice na preparáty Slohy na preparáty

23 kvalita zobrazení biologických objektů závisí na
Kontrastní metody kvalita zobrazení biologických objektů závisí na 1. dostatečném zvětšení obrazu (maximální užitečné zvětšení = numerická apertura objektivu x 1000) 2. rozlišovací schopnosti mikroskopu (numerická apertura objektivu a kondenzoru, kvalita osvětlení preparátu - Koehlerovo osvětlení) 3. kontrastu obrazu (cytologická a histologická barviva, optické metody) 2. Rozlišovací schopnost mikroskopu závisí na numerické apertuře objektivu a kondenzoru a na kvalitě osvětlení preparátu t.j. na optimálním nastavení Koehlerova osvětlení. 3. Kontrast při zobrazování buněk lze velmi efektivně zvýšit pomocí cytologických a histologických barviv Kontrast buněk lze však rovně zvyšovat optickými metodami, které převádějí rozdíly v indexu lomurůzně tlustých částí objektů na jasový kontrast obrazu. Na tomto principu jsou založeny metody jako je např. fázový kontrast, Nomarského diferenciální interferenční kontrast a Hoffmanův modulační kontrast.

24 Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)
Fázový kontrast Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) Hoffmanův modulační kontrast (HMC) Dodtův infračervený gradientový kontrast (DGC) Fluorescence Konfokální laserová skanovací mikroskopie Vznik tohoto modulační kontrastu se datuje do r Jde v podstatě pouze o velmi dokonalou verzí šikmého osvětlení, které se používá ke zvýraznění kontrastu neabsorbujících předmětů. Vznik kontrastu při HMC. je důsledek asymetrické filtrace Fourierova obrazu, což je typické pro všechny metody využívající mimoosové (anaxiální) osvětlení. Virtuálním zdrojem světla zajišťujícím šikmé osvětlení je obdélníková štěrbina nacházející se v přední ohniskové rovině kondenzoru. V místě jejího obrazu v zadní ohniskové rovině objektivu je umístěn modulátor. Modulátorem je maska, jejíž tvar se kryje s obrazem štěrbiny kondenzoru. Štěrbina modulárotu z jedné strany sousedí s absorbující plochou (nepropustná zona, zabírá méně než 10% apertury objektivu), z druhé strany je neabsorbující plocha (propustná zona).. Záření zdroje se po průchodu vzorkem s gradientem optické tloušťky odchýlí od původního směru šíření, jednotlivé příspěvky k odchýlenému záření vytvoří v zadní ohniskové rovině objektivu dílčí obrazy kondenzorové clony, které jsou však posunuty vůči štěrbině modulátoru. Je=li gradient kolmý na osu štěrbiny, posune se její tvar v závislosti na znaménku tohoto gradientu buď do nepropustné nebo do čiré zony modulátoru. Takové posunutí je provázeno ztemněním, při opačném gradientu zjasněním, příslušného místa v mikroskopickém obrazu. Výhody: Výsledný obraz budí dojem šikmo osvětleného reliéfu a je velmi podobný zobrazení pomocí Nomarského DIC, cena potřebných doplňkových komponent mikroskopu je však při HMC podstatně nižší než při DIC. Hlavní předností HMC oproti DIC, kromě ceny, je možnost pozorovat objekty i na dvojlomných podložkách (např. buněčné kultury v plastikových miskách), které se pro DIC, kde je podstatná polarizace zobrazujícího světla, mohou stát zdrojem rušivých efektů. 1.11. Dodtův infračervený gradientový kontrast (Dodt gradient contrast DGC). Tento kontrast byl vyvinut teprve nedávno pro vizualizaci buněk ve tkáňových řezech v minulých deseti letech, jeho princip dosud nebyl zveřejněn.. Tubus je namontován mezi zdroj světla a mikroskop, kontrast je vhodný pro všechny typy objektivů, neinterferuje s fluorescenčním snímáním.

25 Metoda fázového kontrastu
Frits Zernike, 1934 Nobelova cena Zeiss, Jena vlnová délka λ amplituda λ/4 amplituda - intenzita světla vlnová délka - barva fázový posun - neviditelný pro lidské oko ZAŘÍZENÍ PRO FÁZOVÝ KONTRAST změna fáze vlnění na změnu amplitudy = viditelné pro člověka Nebarvené objekty různá optická hustota změna fáze Fyzikální principy fázového kontrastu nejsou snadno přístupné. Naopak praktické používání fázového kontrastu ve světlené mikroskopii nečiní většinou žádné potíže. Stručně můžeme říci, že lidské oko je schopno vnímat rozdíly v amplitudě světelného vlnění jako rozdílnou intenzitu světla a rozdíly ve vlnové délce jako různou barvu světla. Nezbarvené (průhledné) objekty jsou pro světlo téměř všude stejně prostupné, ale protože jejich různé části mají různou optickou hustotu, lomí světlo každá z nich pod jiným úhlem. V důsledku toho se světelné paprsky vystupující z preparátu liší fází svého vlnění, amplituda zůstává nezměněna. Změna fáze světla, která nastává při průchodu objektem, není zrakem přímo viditelná. Nemá-li tedy objekt detaily, lišící se kontrastem, je pro lidský zrak průhledný, čirý. U řady biologických objektů tyto vlastnosti převažují a proto je zrakem obtížně identifikujeme. Mikroskop, vybavený pro pozorování ve fázovém kontrastu, nám umožňuje pozorovat i takové objekty, které způsobují jen fázový posun světla. Hlubší poznatky o tomto principu jsou součástí fyzikální optiky.

26 Kondenzor - aperturní kroužek pro různé zvětšení
Objektivy pro fázový kontrast - fázový prstenec (převádí neviditelné fázové rozdíly na rozdíly amplitudové) Kondenzor - aperturní kroužek pro různé zvětšení Centrovací dalekohled - seřízení fázových prstenců Zelený filtr- 540 nm fázová destička objekt kondenzor objektiv fázová clona Mikroskop pro pozorování ve fázovém kontrastu musí být pro tuto metodu vybaven. Potřebujeme objektivy pro fázový kontrast a kondenzor pro fázový kontrast. Oba tyto optické díly jsou opatřeny tak zvanými fázovými prstenci. U objektivů jsou jejich trvalou částí, u kondenzoru jsou používány podle potřeby. Objektivy pro fázový kontrast mají na jedné ze svých čoček nanesený neprůhledný "fázový" prstenec, na kterém nastává posun fáze světelné vlny. Objektivy pro fázový kontrast mohou sloužit též pro pozorování bez fázového kontrastu, avšak prstenec v objektivu způsobuje v tomto případě mírné snížení jakosti obrazu - udává se přibližně 10 %. U objektivu s malým zvětšením se toto zhoršení prakticky neprojevuje. Fázový kontrast je značně závislý na seřízení mikroskopu. K tomu se dodává účelná pomůcka, tzv. středící (centrovací) dalekohled. Ten se nasadí místo jednoho okuláru a pak pozorujeme polohu fázových prstenců, které můžeme vystředit pomocí nastavovacích prvků. Přesný postup je v návodu ke každému mikroskopu, nicméně vyžaduje trochu zkušeností. Je běžné používat pro světlé pole a fázový kontrast společné objektivy až do zvětšení 40x, pro vyšší zvětšení je téměř nutné používat pro každou metodu jednoúčelový objektiv. Kondenzor pro fázový kontrast bývá u jednoduchých mikroskopů vybaven tzv. šoupátkem, nesoucím 1 nebo 2 fázové prstence. Tyto fázové prstence jsou svým tvarem přizpůsobeny vždy objektivu s určitým zvětšením. Dokonalejší mikroskopy jsou vybaveny univerzálním otočným kondenzorem, vybaveným třemi fázovými prstenci, prstencem pro pozorování v tmavém poli a otvorem pro pozorování ve světlém poli. Volba se provádí otáčením karuselu, nesoucím jednotlivé prstence. Pozorování při fázovém kontrastu se podstatně zlepší, použijeme-li zelený interferenční filtr. Tento filtr propouští zelené světlo vlnové délky kolem 540nm, které zvyšuje vjem kontrastů. Oko je na tuto vlnovou délku světla maximálně citlivé.

27 apodizovaný fázový kontrast
Problém halace apodizovaný fázový kontrast křídlo motýla Malformovaný střední háček diplozoona procházející světlo x fázový kontrast .8. Fázový kontrast R holandský fyzik Frederik Zernike uveřejnil princip fázového kontrastu v mikroskopu. Při fázovém kontrastu je do přední ohniskové roviny kondenzoru vložena kondenzorová maska (apertura ve tvaru úzkého mezikruží), která je kondenzorem a za ním následujícím objektivem zobrazena do zadní ohniskové roviny objektivu. Zde se nachází skleněná podložka s nanesenou fázovou maskou (tenká transparentní vrstva o vhodném indexu lomu) ve tvaru mezikruží, které se překrývá s obrazem kondenzorové apertury. Fázová maska mění fázi procházejícího záření o úhel α, případně může procházející záření také částečně absorbovat. Kontrast obrazu fázového objektu vůči pozadí roste s klesající propustností fázové masky. Fázová destička bývá zhotovena tak, že mění fázi buď o úhel π /2 nebo -π /2. Při fázovém kontrastu se intenzita světla v obrazu objektu mění lineárně se změnou fáze světla procházejícího objektem. S fázovou maskou měnící fázi o -π /2 se silnější části objektu jeví tmavší, tzv. pozitivní fázový kontrast. Při změně fáze o π /2 je tomu naopak, tzv. negativní fázový kontrast. Při fázovém kontrastu se často používá kvazimonochromatického osvětlení (žlutozelené světlo), při použití bílého světla bude obraz vzorku zbarvený, neboť úhel a o který fázová maska mění fázi procházejícího světla, závisí na vlnové délce. Nejmenší rozdíly v tloušťce různých buněčných struktur, které můžeme pomocí fázového kontrastu zaznamenat se tedy blíží k hodnotě 0.1 µm. Nevýhody: Při pozorování silně lomivých objektů (např kvasinek) vzniká tzv. halo, což je jasně zářící rozhraní mezi objektem a okolním prostředím, v němž se ztrácejí skutečné hranice objektů. Druhým nedostatkem fázového kontrastu je to, že silně absorbující zbarvené objekty nemusí být ve fázovém kontrastu vůbec viditelné.

28 Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)
- povrchová topologie objektu kolem 1950, Georges Nomarski mikroskop Carl Zeiss polarizátor Wollastonův hranol kondenzor preparát objektiv analyzátor lineární polarizace světla rozdělení polarizovaného světla na dvě složky interference dvou laterálně posunutých obrazů a srovnání fázových rozdílů v celé ploše obrazu zvětšený obraz vzorku se jeví jako šikmo osvětlený trojrozměrný objekt vzniknou dva identické obrazy objektu, které jsou vůči sobě laterálně posunuty různá tloušťka preparátu = fázové rozdíly Německá firma Carl Zeiss vyvinula r.1959 interferenční mikroskop, který umožnil vytváření a vyhodnocování optických interferencí ve zvětšeném biologickém preparátu. Umožnil tak zvláště povrchovou topologii preparátu. Od běžného mikroskopu se liší vloženým párem Wollastonových dvojlomných hranolů a párem zkřížených polarizátorů světla. Světlo vstupující do kondenzoru je nejprve lineárně polarizováno polarizátorem P1. Pak prochází prvním hranolovým děličem, přičemž směr jeho polarizace svírá s optickými osami hranolového děliče úhel 45°. Druhý hranol shodně orientovaný s hranolem prvním, se nachází těsně za zadní ohniskovou rovinou objektivu. Následuje polarizátor P2, který je kvůli lepšímu kontrastu zobrazení zkřížen s P1. V důsledku rozdělení původně polarizovaného světla hranolem vzniknou dva identické obrazy předmětu, které jsou vůči sobě laterálně posunuty, vznikne zvětšený rozdvojený obraz. Wollastonovy hranoly pro DIC se vyznačují tím, že úhlový rozdíl vystupujících paprsků je velmi malý (asi radiánu), laterální posun dvou obrazů je za těchto podmínek pod hranicí rozlišovací schopnosti mikroskopu. V předmětové rovině je ekvivalentem tohoto posunu vzdálenost odpovídající 0.1 mm. Analyzátor P2 orientovaný pod úhlem 45o vůči vzájemně kolmým polarizacím dvou laterálně posunutých obrazů, vytváří podmínky pro jejich interferenci. Prvním (objektivovým) hranolem způsobené fázové rozdíly však nejsou stejné pro světlo pocházející z různých míst plošného světelného zdroje. Úkolem druhého hranolu (kompenzačního) je proto učinit fázový rozdíl konstantní v celé ploše objektivového hranolu. Hodnotu konstantního fázového rozdílu lze plynule měnit laterálním posouváním obou Wollastonových hranolů vůči sobě, čímž se výrazně ovlivňuje vzhled obrazu. Platí, že pokud určitý gradient optické dráhy vede ke zvýšení jasu obrazu, pak opačný gradient se projeví snížením jasu. Zvětšený obraz vzorku se proto jeví jako šikmo osvětlený trojrozměrný objekt.

29 Ancylostoma duodenale
Clonorchis sinensis červené krvinky řez ledvinou myši příchytné svorky diplozoona pylové zrno borovice

30 Fluorescence, fluorescenční mikroskopie
Koehler 1910 První fluorescenční mikroskop s UV excitací na jeho zkonstruování se podíleli Koehler, Reichert a Lehman epifluorescence - pozorování v odraženém světle diafluorescence - pozorování v procházejícím světle, která se v současné době téměř nepoužívá Oblasti použití fluorescenčních mikroskopů Biologie (zoologie, botanika, mikrobiologie) Medicína (předepsané zkoušky, patologie, anatomie, neurologie, fyziologie, imunologie atd.) Farmacie, chemický průmysl, biochemický průmysl Výzkum a kontrola průmyslových aplikací V r pozoroval Koehler při mikroskopování s ultrafialovým světlem fluorescenci mnoha objektů První fluorescenční mikroskop s UV excitací vznikl v r. 1913, na jeho zkonstruování se podíleli Koehler, Reichert a Lehman

31 Fluorescence je jev, kdy látka absorbuje ultrafialové záření nebo viditelné světlo s krátkou vlnovou délkou a emituje viditelné světlo s delší vlnovou délkou než má světlo absorbované

32 1. fáze - excitace (buzení viditelného záření)
Třístupňový proces : 1. fáze - excitace (buzení viditelného záření) 2. fáze - vlastní doba excitovaného stavu (nevratná přeměna části energie v jiné druhy) 3. fáze - emise (vyzáření světla určité vlnové délky) Energie excitovaného světla je větší než emitovaného (Eex> Eem) Vlnová délka excitovaného světla je menší než emitovaného (ex< em) (nm) viditelné světlo Neviditelné ultrafialové UV infračervené IR Spektrum tzv. bílého světla

33 Schéma prvků fluorescenčního mikroskopu
preparát objektiv excitační filtr dichroické zrcátko bariérový filtr 1. Rtuťová výbojka 2. Excitační filtr 3. Dichroické zrcátko 4. Objektiv 5. Preparát 6. Bariérový filtr rtuťová výbojka

34 1. Světelný zdroj: světlo s různými vlnovými délkami od UV po IR
2. Excitační filtr: propouští pouze světlo, které je potřebné k fluorescenci vzorku, především s kratší vlnovou délkou, ostatní světlo pohlcuje 3. Fluorescenční preparát: Vzorky, které reagují na dopadající světlo fluorescencí (většinou po přidání barviva fluorochromu) 4. Dichroické zrcátko: Odráží excitační světlo o určité vlnové délce směrem do vzorku a propouští ostatní vlnové délky, směrem od vzorku odráží nespotřebované excitační světlo a propouští fluorescenci 5. Bariérový filtr: Blokuje všechno excitační světlo, které nebylo použito a propouští pouze fluorescenční světlo Navíc je možné z fluorescenčního spektra nechat projít pouze jeho část (černé pozadí obrazu)

35 Funkce dichroického zrcátka

36 bariérový filtr excitační filtr zdroj světla dichroické zrcátko optická kostka

37 1. autofluorescence (bez použití barviva)
Celá řada látek fluoreskuje po ozáření UV světlem (některé tkáně, buňky a jejich integrální složky - pigmenty, chlorofyl). chlorofyl Příchytné svorky (skleroproteinové) žaberního parazita kaprovitých ryb Paradiplozoon homoion (Monogenea)

38 2. sekundární fluorescence (metoda chemického barvení)
Pozorování fluorescenčního světla generovaného fluorochromem (fluoreskující barvivo), kterým se obarví látka bez vlastní fluorescence (proteiny, uhlohydráty). Pokud se obarví pouze objekty, které chcete pozorovat, lze je pozorovat odděleně od tkáně a ostatních buněk. Chromozomy fluoreskující díky propidium jodidu Aplikace: vizualizace buněčných jader, chromozómů, cytoskeletu, buněčných stěn atd. DAPI - fluorochrom 4,6-diamino 2-phenylindol Barvení DAPI - jádra kvasinky Saccharomyces cerevisiae

39 3. Fluorescenční barvení protilátek (imunofluorescence)
Molekuly protilátky, označené navázaným fluorochromem, se váží s molekulami specifických buněčných antigenů za vzniku komplexů (antigen+ protilátka + fluorochrom) Vizualizace specifických antigenů, provázejících určité choroby, jejichž množství respektive přítomnost se studuje po reakci antigen/protilátka

40 Nové technologie mikroskop s videokamerou
spojení počítače s mikroskopem digitalizace a analýza obrazu DIGITÁLNÍ MIKROSKOP Olympus MIC-D Místo klasického pozorování pomocí okulárů zobrazuje MIC-D na monitoru osobního počítače, který je s mikroskopem spojen USB kabelem. Protože se jedná o digitální obraz, jeho zpracování je velmi rychlé a snadné: uživatel jej může uložit, vymazat, upravit, vytisknout, umístit na web nebo poslat em.