C7900 Lehká biotechnologie

Prezentace na téma: "C7900 Lehká biotechnologie"— Transkript prezentace:

1 C7900 Lehká biotechnologie
15 – Organické kyseliny Petr Zbořil

2 Osnova prezentace Kyselina octová Kyselina citronová

3 Kyselina octová Tvorba
Oxidací etanolu – 2 enzymy (forma celých buněk – ostatní metabolismus, ale hlavní cesta produkce energie) Oxidace etanolu u A. aceti. Matsushita K. a kol.: J. Bacteriol. 187, (2005)

4 Kyselina octová Jiné cesty – i anaerobní
Častý vedlejší produkt produkt Heterofermentativní procesy Z glukosy aj., méně efektivní

5 Suroviny Etanol čistý, upravený, doplněný dalšími živinami
Etanol ve formě fermentačního media – kvasu (víno, pivo), vyčeřené upravené Glukosa aj. sacharidy, málo užívané způsoby

6 Mikroorganizmy Nejspecifičtější rod Acetobacter, tvoří téměř výlučně kyselinu octovou A. aceti, , xylinum, oxydans, aj. Některé oxidují etanol na další (nežádoucí) produkty H2O a CO2 – přeoxidace, zvl. při vyčerpání etanolu, aj. Další kyseliny – propionová, mléčná, galakturonová, různé příchutě octa Výběr se řídí živným mediem Liší se schopností metabolizovat pivo (vadí chmelové látky), víno, mladinu atd.

7 Způsoby procesu Zakotvený systém, náplňový fermentor – ocetnice
Klasický způsob Submerzní systém, suspenze bakterií v mediu Míchaný fermentor Flotační fermentor – „airlift“

8 Kyselina octová Povrchový způsob, zakotvené bakterie
Fermentor (obvykle dřevěný) o 3 oddílech, střední s náplní (bukové hobliny, lze i jiné – škvára, koks, dřevěné uhlí …) porostlou vrstvičkou bakterií v matrix Skrápí se „ředinou“ – zpočátku ca 10,8% etanol a 1,2% kys. octová, doplněna dalšími živinami – dle typu suroviny (čistý etanol x kvasy) Protiproudem je vháněn vzduch, oxidací etanolu vzniká kys. octová, produkuje se teplo – chlazení! Recirkulace po ca 7-8 dní, pokles etanolu na ca 0,3%, kontrolovat, nebezpečí přeoxidace!

9 Ocetnice Náplň (hobliny) Zásobník řediny, Úprava, T = obtok Výdech
Chladič Teploměry Vzduch průtokoměr Recyklace media

10 Demontáž ocetnice

11 Dubové hobliny

12 Tady stávaly ocetnice

13 Končíme

14 Ocet – povrchový způsob
Zavedení provozu Zaočkováním sterilních (propařených a 8% kys. octovou nasycených hoblin), nárůst vrstvy řádově týdny Nejlépe starým octem – prokvašeným mediem Dosáhne se 14 – 15 % produkt Méně čistou kulturou Produkt 11 – 12 % Periodický provoz – cyklické střídání Odčerpání produktu Aplikace čerstvé řediny – přípravná místnost Regenerace náplně – po 8 – 10 letech (i 20 – 30) Odstranění hlenů propláchnutím vodou

15 Ocet – důležité podmínky
Teplota – 29 – 34 oC (podle polohy) Exotermní pochod, nutnost chlazení Čidla, vnější chladič, rychlost cirkulace – přepad, obtok (mění se i rychlost oxidace etanolu) Snížená aktivita bakterií při vyšší teplotě (i nižší) Vzduchování intenzivní, využije se 50% dodávaného kyslíku 4144 L / 1 L etanolu Koncentrace a čistota etanolu Optimálně 6 – 7 % nad 14 % zastaví proces, pod 1% hrozí přeoxidace Příměsi dodávají příchutě (estery) nebo pachutě Mohou též inhibovat proces

16 Ocet – důležité podmínky
Živiny Sacharidy (glukosa, sacharosa) Minerální komponenty – fosfát, K, Na, NH4+, Mg Voda – obsažena v produktu, příměsi se neředí Nevhodné komponenty ovlivňují chuť, vůni, barvu Vadí Fe, N-látky, tvrdost, mikrobiální kontaminace Úprava podle potřeby – měkčením, sterilizací Kovy Inhibice: Pb  Cu  Fe  Zn  Sn Stimulace uranylacetátem – přidává se (?)

17 Ocet Finální úprava Filtrace Ředění Barvení, aromatizace Pasterizace
Průmyslové využití – 12 – 14 % Potravinářský ocet 8 – 10 % Barvení, aromatizace Vlastní aroma – dle suroviny Bylinné extrakty apod. (estragon) Pasterizace

18 Ocet – submerzní způsob

19 Ocet – submerzní způsob
Kyselinovzdorné ocelové acetátory Sterilní medium se standartně zaočkuje kulturou Bakterie během cyklu rostou Na 1 L octa přiroste 300 g (?) biomasy bakterií Významná intenzivní aerace Min. 4 % O2 ve vycházejícím vzduchu Pod tuto hodnotu klesá výkon proti růstu Přerušení aerace na 60 s nevratně zastaví proces

20 Ocet – submerzní způsob
Provozní fermentor s průtokoměrem vzduchu (acetátor) Rozměry – viz žebřík

21 Kyselina citronová Metabolický základ produkce Citrátový cyklus
Jiné cesty sporadické, dle mikroorganizmu např. kondenzace malátu a glykolátu

22 Kyselina citronová Hromadění Doplňování metabolitů TCA Export
Inhibice dalšího metabolizmu Snížení obsahu Fe v mediu – malá aktivita ICDH Mutanti se sníženou produkcí akonitasy Doplňování metabolitů TCA Anaplerotické dráhy Pyruvát – oxalacetát (karboxylace) – inkorporace CO2 Glyoxylátová zkratka Výtěžky nad 100% pro stechiometrii glyoxylátové cesty, význam karboxylace – experimentálně potvrzeno pomocí 14C Export

23 Kyselina citronová – export
Navržené schema exportu citrátu u A. niger CTP – citrát transportující protein CP – citrát permeasa (? – neidentifikovaný protiion)

24 Kyselina citronová Produkční mikroorganizmy Aspergillus niger
Mutanty se sníženou aktivitou akonitasy a ICDH Zvýšená aktivita enzymů na syntetické cestě Pasážování za vhodných podmínek Udržování vlastností Výběr dle požadovaných vlastností Nejlepší hromadí až 10 % kys. citronovou Některé hromadí i jiné kyseliny Glukonová, oxalová Další uvažovaní producenti

25 Kyselina citronová Produkční způsoby Povrchový – emerzní
Hloubkový, submerzní Míchaný nebo flotační fermentor („airlift“) Fermentace pevné fáze – jednoduchá

26 Kyselina citronová – povrchový proces
Suroviny – sacharidy Melasa Variabilní složení (oblast, typ, ročník, technologie apod.) Stimulující komponenty Koloidní nebo vázaný na koloid Nespotřebovává se, je obsažen i v odpadních louzích Zvyšuje výtěžnost z 25 – 30 % na 55 – 60 % Inhibiční komponenty Kovy (Fe aj.), lépe roste mycelium, horší produkce Úprava dle analýz a testovacích fermentací Řědění na požadovanou konc. sacharosy Odstranění kovů – srážení, katexy Úprava pH (dle typu media), doplnění fosfátu apod.

27 Kyselina citronová – povrchový proces
Media Sporulační – laboratorní fáze Účelem je naprodukovat maximální množství spor k výsevu Není nutno vyloučit produkci vedlejších produktů Ukazatelem je růst a sporulace Produkční Nemají se tvořit konidiospory Mycelium má ukončit vývoj dřív než kvašení (limitace biogenním prvkem, obvykle N) Ukazatelem je produkce citrátu Nemají se tvořit jiné produkty (kyseliny)

28 Kyselina citronová – povrchový proces
Zařízení Kvasné mísy pro povrchovou kultivaci Korozivzdorný materiál Fe s inertním povlakem (smalt), Al Rozměry se řídí podmínkami fermentace a manipulačními možnostmi Výška media 8 – 9 cm Malé jsou neúsporné, velké se mohou deformovat – dle materiálu Kvasné komory pro naskládání mis Regály Rozvod temperovaného (30 oC) sterilního vzduchu

29 Kyselina citronová – povrchový proces
Zařízení

30 Kyselina citronová – povrchový proces
Zařízení

31 Kyselina citronová – povrchový proces
Postup Laboratorní příprava Produkce spor, testování melasy apod. Plnění kvasných mis upravenou sterilní melasou Zaočkování media sporami Směs spor s karborafinem ve asepticky vpraví do proudu vzduchu rozváděného v komorách nad jednotlivé mísy Růst mycelia a fermentace Po ca 36 hod. souvislý povlak Růst extracelulární invertasy, max. ca 4. den Všechna sacharosa hydrolyzována, max. rychlost produkce citrátu Sleduje se titrační kyselost a gravimetricky stanovuje citrát Ca Pokles produkce, odtažení media (hadičky) k izolaci

32 Kyselina citronová – izolace
Stažení kvasu do usazovacích kádí Mycelium lze ev. znovu použít – zůstane v mísách Mycelium lze sebrat, rozdrtit, extrahovat vodou (60 oC) Filtrace usazeniny a ev. extraktu Srážení Ca-citrátu Čirý roztok z usazováku a filtrát, přídavek Ca(OH)2 při 40 – 50 oC Reakcí se směs zahřeje na 70 – 80, parou pak na 95 oC, míchání 15 min. Odfiltrování Ca-citrátu (vakuová nuč, bubnový filtr)

33 Kyselina citronová – izolace
Uvolnění kys. citronové Sraženina se rozloží kys. sírovou při ca 70 oC Oddělení CaSO4 filtrací Filtrát se nechá ochladit a usadit (CaSO4), další filtrace Krystalizace Zahuštění filtrátu na vakuové odparce Krystalizace (I. Zrno) Opakování (II. A III. Zrno) Další čištění, rafinace (II. a III. zrno) Podle účelu, dalšího užití Karborafin, ionexy

34 Kyselina citronová – izolace

35 Kyselina citronová Využití Potravinářství – ca 65% Farmacie – ca 20%
Nápoje, kompoty, zmrzlina apod. Chuťové, konzervační a antioxidační vlastnosti Farmacie – ca 20% Antikoagulační činidlo Ostatní – ca 15% bělění, leptání mycí a čistící prostředky – náhrada fosfátů

36 Kyselina citronová – submerzní fermentace
Moderní způsob, většinou nahradil ostatní Mycelium tvoří granule, pelety Od 2. pol. r zavedeno u nás, dnes výroba zanikla Substrát se připravuje a steriluje v tanku Produkční medium se připraví a sterilizuje ve fermentoru Současně se připraví zaočkuje růstové medium sporami na nosiči (obilná zrna) Po 24 h se vytvoří ze shlukujících se hyf pelety Peletami se zaočkuje produkční fermentor Fáze růstu je po ca hod. vystřídána fází produkční, hromadí se kys. citronová

37 Kyselina citronová – submerzní fermentace
Výhody Úspora prostoru Vyšší kapacita Jednodušší operace Mechanizace a automatizace Menší nebezpečí kontaminace Nevýhody Nižší výtěžky Vzniká více kyseliny glukonové a šťavelové

38 Kyselina citronová - Kaznějov