KOMPLEMENTFIXAČNÍ REAKCE, NEUTRALIZACE

Prezentace na téma: "KOMPLEMENTFIXAČNÍ REAKCE, NEUTRALIZACE"— Transkript prezentace:

1 KOMPLEMENTFIXAČNÍ REAKCE, NEUTRALIZACE
Lékařská mikrobiologie – cvičení, jarní semestr 2016 Mikrobiologický ústav LF MU

2 Osnova Opakování Dynamika titru Komplement Komplement fixační reakce
Neutralizační test

3 Opakování Přímé metody: hledáme mikroba, jeho části nebo produkty (antigeny, toxiny,...). Infekční agens je přítomno nyní. Nepřímé metody: hledáme protilátky vytvořené makroorganismem, které vznikly jako odezva na činnost mikroba. Infekční agens bylo přítomno někdy v minulosti.

4 Přehled nepřímých metod
precipitace (J06) aglutinace (J06) aglutinace na nosičích (J06) komplementfixační reakce (KFR) (J07) neutralizační reakce (J07) metody se značenými složkami: Imunofluorescence ELISA Western blot

5 Interpretace nepřímých metod
Průkaz antigenu: pozitivita = přítomnost mikroba v těle pacienta Průkaz protilátek: pozitivita = pacient se s mikrobem setkal. Kdy? Nutno odhadnout dle: Relativní množství protilátek (titr) a jeho změny v čase (dynamika titru) Třídy protilátek – IgM/IgG Avidita protilátek (na počátku infekce jsou přítomny nízkoavidní Ab)

6 Interpretace – primární a sekundární imunitní odpověď
Akutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM, případně IgM i IgG Pacient po prodělané infekci: malé množství protilátek, pouze IgG (imunologická paměť) Chronická infekce: různé možnosti podle aktivity infekce, mikrobiálního druhu apod.

7 Párová a nepárová séra Párová séra – dva vzorky: první uchováván v ledničce do doby, než dorazí vzorek druhý – rekonvalescentní (v rozmezí 10 – 21 dní). Oba jsou pak hodnoceny naráz. Signifikatní je čtyřnásobný vzestup titru mezi jednotlivými vzorky  akutní infekce. Nepárová séra – dva vzorky, ale nejsou vyšetřovány společně. Zvětšuje se tak riziko náhodné chyby, a proto jako důkaz akutní infekce nestačí čtyřnásobný titr, ale osminásobný titr.

8 Titr protilátek Titr = nejvyšší ředění, kde ještě vidíme pozitivní reakci. (Máme-li dvě řady, je titrem nejvyšší ředění z obou řad dohromady.) Prokazujeme reakci imunitního systému  ta může být velice variabilní mez jednotlivými pacienty. Málo reaktivní pacient (nízká hodnota titru i v akutní fázi infekce) vs. velmi reaktivní pacient (vysoká hodnota titru i po uplynutí dlouhé doby od prodělán infekce).

9 Titr protilátek – dynamika titru (1)
Z předchozího slidu vyplývá, že se tedy nelze spolehnout na samotnou výši titru, ale je nutno vycházet z dynamiky výše titru. Po prvním styku s Ag trvá až 10 dní, než je lze detekovat běžnými serologickými metodami  v prvních dnech infekce jsou serologické reakce často negativní.

10 Titr protilátek – dynamika titru (2)
Velikost a dynamika titru neodpovídají klinickým příznakům!!! Množství protilátek vrcholí často až po vymizení příznaků. Lze prokazovat také pokles titru  subakutní infekce. Serokonverze = v prvním vzorku protilátky nejsou (ještě se nestihly vytvořit), v druhém už jsou. Takový důkaz je cennější než „důkaz čtyřnásobkem“. Serokonverze vyžaduje, aby pozitivní nález ve druhém vzorku byl o jedno ředění vyšší než základní ředění (např. základní ředění 1:4, pozitivní nález ve 2. vzorku alespoň 1:8)

11 Titr protilátek – dynamika titru (3)

12 Komplement (1) Součást nespecifické (humorální) imunity
Systém sérových a membránových glykoproteinů. Nejdůležitější proteiny jsou C1 – C9. Komplement váže komplex Ag-Ab, nemůže samostatně vázat Ag a samostatně Ab. Fungují v kaskádě: nejprve dojde ke štěpení neaktivní složky na menší biologicky aktivní část (mediátory zánětu C3a, C4a a C5a) a větší proteolyticky aktivní část (proteinové fragmenty b) konečný produkt: komplex atakující membránu mikroorganismu  vytvoří pór  lyze buňky

13 Komplement (2)

14 Komplement – aktivace Liší se od sebe způsobem aktivace C3 složky. Nejdůležitější moment při aktivaci komplementu je tvorba C3b z C3. 3 různé cesty aktivace kaskády: Klasická – aktivace komplexem Ag-Ab, nutná přítomnost protilátek. Alternativní – aktivace povrchem patogenu, C3b slouží k opsonizaci patogenu. Lektinová– lektiny = proteiny schopny specificky rozpoznávat a vázat volné i vázané cukry.

15 Komplement fixační reakce
Reakce využívá vlastností komplementu – vazby na komplex Ag-Ab a schopnost komplementu lyzovat buňku. Samotná vazba komplementu na Ag-Ab komplex není viditelná  přidávají se indikátory. Indikátorový systém je tvořen Ag a Ab, aby se na něj mohl komplement také navázat: Ag = beranní erytrocyty Ab = králičí Ab proti beraním erytrocytům (amboceptor)

16 Komplement fixační reakce – princip (1)

17 Komplement fixační reakce – princip (2)
Pozitivita: sediment erytrocytů (komplement je vyvázán komplexem hledaného Ag a Ab) Negativita: hemolýza erytrocytů (nedošlo k vyvázání komplementu  zlyzoval ery) Používá se morčecí komplement, ne pacientův. Inaktivuje se zahřátím tak, aby nebyly poškozeny pacientovy protilátky (30 min/56 minut).

18 Falešná pozitivita a negativita KFR
Falešná negativita: Příliš mnoho komplementu hemolyzuje ery i v přítomnosti hledaného komplexu Ag-Ab Nutná kontrola – titrování komplementu Falešná pozitivita: Některá složka séra vyvazuje komplement sama o sobě, případně je sérum kontaminované Předcházíme tomu testem antikomplementarity = běžně provedený test, ale bez přidání Ag  pokud i tak dojde k vyvázání komplementu, nehodnotí se výsledek a krev je odebírána znovu

19 Neutralizační reakce Neutralizační reakce: serologické metody, při nichž protilátka brání běžným projevům antigenu (nejčastěji viru) Virus neutralizační test – Ab neutralizuje infekčnost viru – buněčná/tkáňová kultura je naočkována směsí viru. Pokud je přítomno Ab  beze změny (metabolický efekt, pH, fenolová červeň). Hemaglutinační inhibiční test – v přítomnost Ab není virus schopne aglutinovat erytrocyty (pozor, ne hemolyzovat!!!) ASLO = průkaz antistreptolyzinu O (protilátky schopné vyvolat autoimunitní reakci), nejde o nepřímý průkaz!

20 ASLO – diagnóza pozdních následků streptokokových infekcí
Po každé infekci streptokokem dochází k tvorbě Ab, včetně Ab proti streptolyzinu O = streptokokový toxin Pokud po skončení infekce stoupá množství těchto Ab, dochází ke zkřížené reakci s některými strukturami organismu = pozdní následky strept.infekcí (revmatická horečka, glomerulonefritida) ASLO: zjišťuje míru protilátkové odpovědi po prodělané streptokokové infekci – hledáme přímo protilátky, ne patogen.

21 Úkol 1: Ověření funkce indikátorového ystému pro KFR
Jaké složky jsou nutné pro správnou funkci indikátorového systému? Pozn. Amboceptor = králičí protilátka proti beraním erytrocytům Výsledek: 1), 3), 4) – není hemolýza 2) – hemolýza

22 Úkol 2: Schematická analýza KFR vč. testování antikomplementarity
Ve schématech určete, kde zůstává v první fázi volný komplement – zakroužkujte, co platí Slovně popište výsledek (hemolýza, sedimentace erytrocytů)

23 Úkol 3: Stanovení protilátek u respiračních nákaz (1)
Pacient: dlouhotrvající respirační problémy, minimum klinických projevů. Nejpravděpodobnější diagnóza: atypická pneumonie (může být způsobena respiračními viry, vzácně některými bakteriemi – Mycoplasma, Chlamydia) Pokud je agens bakterie, účinkovala by ATB terapie

24 Úkol 3: Stanovení protilátek u respiračních nákaz (2)
Celá destička patří jednomu pacientovi. Testujeme 6 respiračních patogenů, každý je ve dvou řádcích (vzorek akutní a vzorek rekonvalescentní). První sloupec = test antikomplementarity. Další sloupce = ředění séra. Ve druhém sloupci 1:5, dále geometricko řadou s koeficientem 2. 5 virů (chřipka A, chřipka B, parainfluenza, adenovirus, RS virus), 1 bakterie (Mycoplasma pneumoniae).

25 Úkol 3: Stanovení protilátek u respiračních nákaz (3)
Odečtěte titry KFR u jednotlivých pacientů. Zakreslete výsledky, zapište titry, pokuste se interpretovat závěr. Věnujte pozornost testu antikomplementarity!

26 Úkol 3: Stanovení protilátek u respiračních nákaz (4)
Chřipka A: oba titry 1:5 (pacient se s onemocněním setkal dříve, nejde o akutní onemocnění. Chřipka B, parainfluenza, adenovirus, RS virus: žádné protilátky, pacient se s infekcí nikdy nesetkal. Mycoplasma pneumoniae: vzestup titru z 1:10 na 1:160 (16násobný vzestup  signifikantní výsledek)  podezření na probíhající akutní infekci způsobenou Mycoplasma pneumoniae

27 Úkol 4: Stanovení protilátek (klíšťová encefalitida)
3 pacienti s podezřením na klíšťovou encefalitidu. Všichni neurologické potéže, anamnéza po přisátí klíštěte. 1. řádek = pozitivní kontrola 2. a 3. řádek = první pacient Karel 4. a 5. řádek = druhý pacient Leona 6. a 7. řádek = třetí pacient Monika První z obou řádků odpovídá akutnímu vzorku séra, druhý rekonvalescentnímu. 1. sloupec = test antikomplementarity, následuje ředění geometrickou řadou od ředění 1:4 (dále 1:8, 1:16, 1:32,...)

28 Úkol 5: Stanovení protilátek (toxoplasmóza)
Několik pacientů s podezřením na protilátky proti toxoplasmóze. Toxoplasma gondii = tkáňový parazit, definitivním hostitelem je kočka. Seronegativita = nikdy se s infekcí nesetkal nebo infekce probíhá příliš krátce na detekci protilátek. Seropozitivita = nutno bližší zkoumání. 1. řádek = pozitivní kontrola 1. sloupec = test antikomplementarity (neřešíme dynamiku titru) Rozhodněte, zdali je výsledek pozitivní/negativní/antikomplementární.

29 Úkol 6: ASLO (1) neutralizace hemolýzy streptolyzin O
za běžných okolností (nepřítomnost protilátek) – hemolyzuje červené krvinky Negativní = hemolýza v přítomnosti protilátky antistreptolyzinu O dochází k zábraně hemolýzy a krvinky mohou sedimentovat Pozitivní = zábrana hemolýzy

30 Úkol 6: ASLO (2) Odečet destičky = naležato
První řádek je pozitivní kontrola, další řádky jsou jednotliví pacienti Hodnoty ředění jsou uvedeny v protokolu

31 Úkol 6: ASLO (3) Výsledky:
vysoké riziko pozdních následků je u pacientů číslo 3 a 4 (506, resp. 337 m. j.) hraniční riziko je u pacienta č. 1 (225 m. j.) a u pacienta č. 7 (180 m. j.) u pacientů č. 2 a 6 riziko prakticky není, titry jsou, ale nízké pacient číslo 5 se vůbec nesetkal s příslušným antigenem (je-li vyšetřován pro „prodělanou angínu“, šlo nejspíše o angínu virového či jiného nestreptokokového původu)

32 Úkol 7: Hemaglutinační neutralizační test (1)
Několik pacientů s podezřením na klíšťovou encefalitidu, již testovaných pomocí KFR (viz úkol 4) HIT jako nezávislý test k ověření výsledků KFR (pozor jedná se o jiné pacienty než v úkolu 4!) V přítomnosti Ab není virus schopen aglutinovat erytrocyty (nikoli hemolyzovat!) Pozitivní = sedimentace erytrocytů (protilátka zabránila shlukování, erytrocyty sedimentují) Negativní = shluk krvinek (protilátka nebyla přítomna nebo jí byla příliš málo, nedokázala zabránit viru ve shlukování krvinek)

33 Úkol 7: Hemaglutinační neutralizační test (2)
Odečtěte výsledky HIT u klíšťové encefalitidy – čtyři pacienti (K, L, M, N), u každého akutní a rekonvalescentní sérum 1.řádek = pozitivní kontrola 1.sloupec = ředění 1:5, dále geometrickou řadou s koeficientem 2 (1:10, 1:20, ...) Učiňte pravděpodobný závěr (akutní infekce/pouze paměťové protilátky/...) Kontrola Ag – kontroluje, že antigen (virus) bez protilátky je schopen shlukovat Kontrola erytrocytů – kontroluje, že erytrocyty neshlukují samy od sebe

34 Úkol 7: Hemaglutinační neutralizační test (3)
Mělo by vyjít: jeden z pacientů je zřejmě akutně nemocen dva se s infekcí setkali jeden se nesetkal

35 Po tomto cvičení byste měli umět
Vysvětlit, co je dynamika titru. Rozumět pojmu komplement. Popsat komplement fixační reakci včetně příkladů jejího použití. Diskutovat falešnou pozitivitu a negativitu KFR včetně toho, jak těmto situacím zabránit. Popsat princip neutralizčních testů včetně příkladů. Znát použití metody ASLO.