Bioelektrické jevy a jejich měření

Prezentace na téma: "Bioelektrické jevy a jejich měření"— Transkript prezentace:

1 Bioelektrické jevy a jejich měření
2. přednáška

2 The Atlantic Telegraph Company
Z minulé přednášky: 1902 – J. Bernstein – biopotenciály nervových a svalových buněk existují díky membráně, která je selektivně propustná pro draslík, kvantitativně odpovídající Nernstově vztahu (tehdy mluvil ještě o hypotetické membráně) – v tom se ale mýlil 1910 – J. Bernstein a L. Hermann popsali nervový impuls jako „putující potenciál aktivity“ 1939 – Alan Lloyd Hodgkin a Andrew Fielding Huxley – měření akčního potenciálu pomocí longitudinálních mikroeletrod zasunutých v obřích vláknech hlavonožců, NC 1963 1952 – Hodgkin, Huxley a Bernard Katz – nahrazení Bernsteinovy představy iontovou membránovou teorií : The Atlantic Telegraph Company 1866 ! ÚSPĚCH ! Trinity Bay Dr Edward Orange Wildman Whitehouse profesor William Thomson FRS. (lord Kelvin) "One thing we may prophesy of the future for certain – it will be unlike the past. Everything is in a state of evolution and progress. “ (Lord Kelvin)

3 Ze změny potenciálu lze vyčíst, kolik iontů se kam přesune.
Absolutní potenciál bodového náboje ve vzdálenosti r od náboje: V = 4peor Q permitivita vakua eo = 8, F.m-1 Příklad: V jaké vzdálenosti od náboje 1 mC naměříme hodnotu potenciálu 1 V? [cca 9 km] Ze změny potenciálu lze vyčíst, kolik iontů se kam přesune. 1 C představuje asi 6, jednotkových, elementárních nábojů (1/e). Fradayova konstanta je náboj 1 gramionu elementárních nábojů: je to součin Avogadrovy konstanty a elementárního náboje: F = NA . e = 6, x 1, = C.mol-1 V elektrickém poli o intenzitě E se kladné částice dají do pohybu v kladném směru intenzity pole, záporné v opačném směru. Uspořádaný pohyb náboje se nazývá elektrický proud. El. proud značíme I; je to základní veličina soustavy SI, jeho jednotkou je ampér . 1 A představuje množství náboje 1 C, který projde vodičem za 1 s: I = t Q [I] = A Mezi konci tohoto vodiče můžeme naměřit napětí U. Vztah mezi proudem a napětím pak popisuje Ohmův zákon: U = I . R R je odpor vodiče. Čím větší je odpor vodiče, tím větší napětí musí být na jeho koncích, aby jím protékal proud I – a naopak.

4 A) Kanály v membráně a membrána samotná jako vodiče
U Pro velikost odporu vodič plyne z Ohmova zákona: [R] =  = V . A-1 Jednotkou vodivosti G (g z guide, vést) je siemens S: (vodivost je převrácená hodnota odporu) G = R 1 [G] = -1 = S Nervové vlákno je vodič a lze jej tedy jako vodič / elektrický obvod schematizovat. I1 I2 I U + - I1 = R1 U G1 G2 g1 g2 U Zapojení vodičů vedle sebe = paralelně; paralelně zapojené vodiče se chovají jako jeden vodič. Tímto způsobem lze vyjádřit i elektrické chování membrány samotné. I2 = R2 U I = I1 + I2 = R1 U + R2 A) Kanály v membráně a membrána samotná jako vodiče R2 1 I = U ( ) R1 R2 1 R1 R = + 1. Kirchhoffův zákon (součet proudů vstupujících do uzlu = součtu proudů vystupujících z uzlu) G = G1 + G2

5 B) Axoplasma (cytoplasma nervového vlákna) jako vodič U = I . R
+ - U1 U2 U3 U1 = I . R1 U2 = I . R2 U3 = I . R3 Zapojení vodičů za sebou = sériově. Proud se nikde nemůže hromadit, je stejný při vstupu i výstupu do/z každého vodiče. Napětí na jednotlivých vodičích je tedy úměrné jejich odporu. U = I . (R1 + R2 + R3) Odpory sériově zapojených vodičů se sčítají. R = R1 + R2 + R3 C) Celkové schéma nervového vlákna jako vodiče rm ri U Ekvivalentní elektrický obvod představující nervové vlákno (zatím ignorujeme tzv. kapacitu membrány). rm... odpor membrány (1.103  cm2) ri... podélný odpor axoplasmy (30  cm) Membrána a všechny struktury v ní lokalizované se pokrývají nábojem. Pokud jsou různé vodiče (membrána, kanály, přenašeče...) pokryty stejným nábojem, není jejich elektrický potenciál obecně stejný. Potenciál vodiče se bude měnit podle jeho tvaru, podle jiných těles, které jsou v jeho přítomnosti, a pod. Všechny tyto vlivy shrnuje veličina nazvaná kapacita vodiče.

6 Membrána je velmi tenké a velmi kvalitní dielektrikum.
Kapacita membrány Membrána buňky odděluje od sebe nevodivě dvě prostředí s různou koncentrací iontů. Část iontů – náboje z okolního prostředí se rozprostře i po jejím povrchu: membrána se nabíjí. Nevodivé látky obklopené z obou stran vodiči slouží jako kondenzátory. V tomto případě jsou vodiči vodné roztoky z obou stran membrány a izolačním materiálem, dielektrikem, je sama membrána. Vodiče se nabíjejí stejně velkými, ale opačnými náboji +Q a –Q. Tím mezi nimi vznikne napětí U. Kapacita membrány se definuje jako podíl kladného náboje a tohoto napětí: C = U Q [C] = C . V-1 = F (farad) Farad je dost velká jednotka, v praxi mikrofarady – pikofarady. Typická kapacita membrány neuronu je 1 mF na cm2. Modelová buňka o průměru 25 mm a povrchu cm2 (8 000 mm2) má tedy celkovou kapacitu membrány F, tj. 80 pF. Při membránovém potenciálu -70 mV tedy naaukumuluje na svém povrchu C náboje na cm2. Při daném povrchu je to C náboje, což odpovídá 3,5.107 kusů elementárního náboje (např. záporných iontů na vnitřní straně membrány). Membrána je velmi tenké a velmi kvalitní dielektrikum. + =

7 Membrána je velmi tenké a –přinejmenším její lipidická složka- velmi
Membrána je velmi tenké a –přinejmenším její lipidická složka- velmi kvalitní dielektrikum. Jde vlastně o soustavu paralelně zapojených kondenzátorů, které dohromady považujeme za jeden kondenzátor. Při spojení kondenzátorů s kapacitou C1, C2 ... Cn se jejich kapacity sčítají. + = C1 C2 R1 R2 + = Membrána je ale také baterie paralelních odporů. Celkově tedy náhradní schéma membrány vypadá takto: RC člen rm ri U cm Ekvivalentní elektrický obvod představující nervové vlákno se zahrnutou kapacitou membrány. cm... kapacita membrány (1 mF na cm2) rm... odpor membrány (1.103  cm2) ri... podélný odpor axoplasmy (30  cm) Zatímco u obvodů ovlivněných čistě Ohmovým zákonem je napětí úměrné proudu (U = I.R), u obvodů s kapacitou se musí nejdříve nabít kondenzátor, pak jde proud i k odporu. Postupně s nabíjením kondenzátoru roste i napětí – napětí je v těchto obvodech funkcí času. Na konečnou hodnotu napětí roste exponenciálně s časovou konstantou t = R.C.

8 Postupně s nabíjením kondenzátoru roste i napětí – napětí je v těchto obvodech funkcí času. Na konečnou hodnotu napětí roste exponenciálně s časovou konstantou t = R.C. U (t) = I. R (1 – e –t/t) U Ir Ic U = Q / C dU / dt = I / C U = I. R Časová konstanta t udává dobu, za kterou potenciál dosáhne 63% své výsledné hodnoty (1 – 1/e). t = R.C (1) I(t) = Ir + Ic I(t) = Um Cm dt 1 rm dUm . Ir = 1 rm Um (2) (5) Ic = = dQ dt d(CmUm) (3) V = I(t) . Rm (1 – e ) -t /  (6) Ic = Cm . dUm dt (4) (7)  = rm. Cm

9 Pasivní elektrické vlastnosti membrány: délková konstanta λ
Axoplasma Aplikační elektroda Registrační elektroda Do nervového vlákna aplikujeme krátký pravoúhlý puls. Napěťová změna tím vyvolaná se šíří oběma směry od místa vpichu a její velikost se vzdáleností klesá. Tento pokles je exponenciální a lze jej charakterizovat pomocí délkové konstanty λ. Vnější roztok rm ri U cm Proud Vzdálenost od elektrody (mm) Ux = U0 (e –x/l) Délková konstanta λ udává vzdálenost od místa aplikace proudu, kde poklesne napěťová odpověď na 1/e, tj. 37% odpovědi v místě aplikace (U0). vzdálenost Um x U0 Délková konstanta λ závisí na Toto je tzv. šíření s dekrementem, úbytkem. odporu vnějšího roztoku ro, odporu membrány rm a odporu uvnitř axonu či svalového vlákna ri. rm ro + ri λ2 =

10 Odvození délkové konstanty pro zájemce
Ii = - 1 ri dVi dx Při vzdálenosti x =  je V = 0  B = 0 ; řešení Im = V . 1 rm dx Im = - dIi rm/ri -x V = Vo . e ( ) rm ri λ = dx dIi V = rm . Im = - rm V = - rm . d ( ) dx 1 ri dVi rm = Rm / 2pa ri = Ri / pa2 V = rm ri d2Vi dx λ = = ( ) Rm / 2pa Ri / pa2 ( ) Rm Ri a 2 V = Vo . e + Vo . e -x rm/ri POZOR: pokud si to odvodíte s výše uvedenými jednotkami pro rm ( cm2) a ri ( cm), zjistíte, že jednotka délkové konstanty l vám nevyjde v mm. Je to tím, že výše uvedené jednotky jsou přepočteny na jednotku délky vlákna a jeho tloušťka už se nebere v úvahu, je započítána. Aby l vyšla v mm, počítejte s jednotkami [rm]  krát cm a [ri]  na cm. Jednotky rm a ri, jak jsem vám je uvedla výše, ale najdete v drtivé většině neuro učebnic.

11  ( ) rinput = 0,5 (rm ri) ½ rm ro + ri λ2 =
Délková konstanta λ závisí na ro , rm , ri: ro zanedbáváme (= 0), takže rm ri λ2 =   λ = rm ri U cm ( ) rm ri λ = [λ] = mm Maximální napětí U0 je podle Ohmova zákona (U = I.R) úměrné velikosti aplikovaného proudu. Konstantou této úměrnosti je odpor, v případě vlákna tzv. vstupní odpor vlákna rinput. Tento vstupní odpor závisí na podélném odporu axoplasmy i na odporu membrány: rinput = 0,5 (rm ri) ½ [rinput] =  Konstanta 0,5 je tam proto, že napěťová změna se šíří oběma směry od místa aplikace, obě části vlákna mají vstupní odpor úměrný (rm ri) ½. Platí, že λ bude delší, když bude menší únik proudu přes membránu ven, t.j. čím větší bude rm (ať už zmenšením plochy membrány, nebo vyšším specifickým odporem – např. méně kanálů v membráně) a čím menší odpor proudu bude klást vnitřek axonu ri a okolí ro. Z naměřených hodnot vstupního odporu a délkové konstanty lze snadno vypočítat rm a ri . Tato čísla nám ale neposkytnou příliš přesnou informaci o odporových vlastnostech membrány nebo axoplasmy, protože tyto vlastnosti závisí na průměru vlákna. 1 cm úsek membrány vlákna s malým průměrem může mít vyšší odpor membrány než 1 cm úsek vlákna s větším průměrem, protože menší vlákno bude mít menší povrch membrány. A nebo třeba naopak, vlákno menšího průměru může mít membránu hustěji osázenu iontovými kanály a tím stejný odpor membrány na 1 cm jako vlákno průměru většího. Membrány rozdílných vláken lze srovnat pomocí jejich specifického odporu Rm.

12 rm = Rm / 2pa Rm = 2parm ri = Ri / pa2 Ri = pa2 ri
(A) Membrány rozdílných vláken lze srovnat pomocí jejich specifického odporu Rm. Tento odpor je nezávislý na geometrii vlákna a umožňuje nám porovnávat membrány dvou buněk různého tvaru či velikosti. Specifický odpor membrány Rm je odpor 1 cm2 membrány vlákna o poloměru a. 1 cm takového vlákna bude mít plochu 2pa cm2: rm = Rm / 2pa rm ri U cm Rm = 2parm [Rm] =  cm2 Průměrné hodnoty Rm se pohybují od méně než 1000  cm2 (membrány s velkým množstvím kanálů) po víc než  cm2 (membrány s málo kanály). (B) Axoplasmy rozdílných vláken lze srovnat pomocí jejich specifického odporu Ri. Specifický odpor axoplasmy Ri je podélný odpor 1 cm délky axonu o poloměru a a o průřezu 1 cm2: ri = Ri / pa2 Ri = pa2 ri [Ri] =  cm Specifický odpor axoplasmy závisí na teplotě a na koncentracích iontů v axoplasmě. Průměrná hodnota Ri axoplasmy obřího vlákna sépie je asi 30 cm při 20°C, což je 107krát více než u měděného drátu. Savci mají nižší koncentraci iontů v axoplasmě než hlavonožci, jejich typický průměrný Ri je asi 125 cm při 37°C. Žáby mají axoplasmatickou koncentraci iontů ještě nižší, jejich průměrný Ri se pohybuje okolo 250 cm při 20°C.

13 Válcovité nervové vlákno má podobnou stavbu jako elektrický kabel – centrální vodič a izolační vrstvu kolem něj. Lord Kelvin analyzoval tok proudu v podmořských telefonních kabelech natažených na dně Atlantiku. Jeho práci později upravil Oliver Heaviside a byla známa jako kabelová teorie. Na nervová vlákna ji prvně použili Hodgkin a Rushton, když měřili extracelulárně šíření proudu podél humřího axonu. Kabelová teorie pracuje (zejména) s pasivními elektrickými vlastnostmi vláken. K čemu to je? Akční potenciál (AP) vzniká jen ve vzrušivé části membrány, ne na membráně vstupní. Na membráně vstupní se akumulují různé vstupní podněty (příspěvky excitačních synapsí na dendritech neuronu, bolestivé podněty na nociceptorech a pod.), které vyvolají drobnou depolarizaci. Ta se elektrotonicky šíří dál až ke vzrušivé membráně. Aby mohl vzniknou AP, musí se tato depolarizace dostat co nejdále s co nejméně zmenšenou amplitudou. Délková konstanta λ udává vzdálenost od místa aplikace proudu, kde poklesne napěťová odpověď na 1/e, tj. na 37% odpovědi v místě aplikace (U0). Jinými slovy, λ určí, v jaké amplitudě se určitý vstup dostane ke vzrušivé membráně. vstupní membrána iniciální segment Je tedy žádoucí, aby byla hodnota λ co největší a napěťová změna se dostala v co největší amplitudě co nejdále od místa svého vzniku. Hodnota λ je přímo úměrná „děravosti membrány“, odporu membrány rm, a průměru vlákna a. rm = Rm / 2pa λ = = ( ) Rm / 2pa Ri / pa2 ( ) Rm Ri a 2 ri = Ri / pa2 ( ) rm ri λ =

14 Určitý neuron má za různých fyziologických situací různé vzorce aktivity; salva AP závisí na velikosti napětí a době trvání napětí. Délková konstanta určí, v jaké amplitudě se určitý vstup dostane ke vzrušivé membráně. Když impuls na dané místo dorazí, nevyvolá AP hned, ale až po době, která závisí na časové konstantě – membrána se musí nejprve nabít jako každý kondenzátor. Časová konstanta t udává dobu, za kterou potenciál dosáhne 63% své výsledné hodnoty (1 – 1/e). Časová konstanta t je tedy mírou toho, jak velké proudy tekou v daném místě membrány. vstupní membrána iniciální segment Se vzdáleností od místa vzniku klesá amplituda podnětu. Příspěvek synapse vzdálenější od iniciálního segmentu je menší než příspěvek synapse ležící blíže, pokud obě produkují podnět stejné maximální amplitudy a pokud má membrána všude stejné elektrické vlastnosti. t = R.C U synapsí na těle neuronu je žádoucí, aby t byla co nejdelší – jen tak může dojít k časoprostorové sumaci (podnět vyvolá nějakou depolarizaci, která nějakou dobu dosahuje svého maxima a stejně dlouhou dobu odeznívá – tato doba musí být dost dlouhá, aby mohlo docházet k sumaci. Při stále aplikaci podnětu o téže síle (velikosti amplitudy) se po době = t zase opakuje vznik AP. Při aplikaci podnětu o vyšší síle vznikne další AP za zlomek t. Při stálé aplikaci tohoto silného podnětu zase vznikne další AP za stejný zlomek t  frekvence AP závisí na síle podnětu (vzrůst intenzity podnětu má za následek vzrůst frekvence vzniku AP).

15 Medical Physiology by Walter F. Boron and Emile L
Medical Physiology by Walter F. Boron and Emile L. Boulpaep, 2nd edition published by Elsevier

16 Myelinizace a její výhody
Z potřeby co nejvyšší hodnoty délkové konstanty l vyplývají dvě strategie pasivního šíření impulsu podél axonu:  snížení vnitřního odporu axoplasmy ri zvýšením průměru vlákna. Touto cestou se vydali např. hlavonožci: obří vlákno sépie má l až 13 mm (tj. pokles amplitudy vzruchu na cca 1/3 až ve vzdálenosti 13 mm od místa jeho vzniku).  nebo zvýšení membránového odporu rm – např. myelinem jako vydatnějším isolantem, než je „jen“ membrána. Myelinizace a její výhody Myelin je složitá lipidicko-proteinová substance produkovaná gliovými buňkami (na periferii Schwannovými b., v CNS oligodendrogliemi). Proteinové složení myelinu v CNS a PNS se liší: centrální myelin obsahuje zásaditý myelinový protein (MBP) a proteolipidický protein (PLP, též Folch-Lees protein). Periferní myelin obsahuje MBP a protein nula (P0). Oba obsahují další menší proteiny, nejzajímavější z nich je asi s myelinem-asociovaný glykoprotein (MAG). MBP je bohatý na kladně nabité zbytky lysinu a argininu. Tím je přitahován k obecně záporně nabitému P-listu membrány; může do ní i zapouštět N-konec a stabilizovat ji tak. P0 je člen superrodiny zahrnující Ig, CAM aj. Jeho extracelulární doména je podobná Ig a interaguje s toutéž doménou P0 v sousední membráně.

17 Proteinové složení lidského centrálního a periferního myelinu
Intraperiod line Enzymy myelinu: cholesterol-esterhydrolasa, N-acetyl-L-aspartát- aminohydroxylasa, cAMP-kinasa, Ca/CaM-kinasa, proteinkinasa, fosfatasy, enzymy metabolismu strukturních lipidů (cholesterol esterifikující enzymy, steroidy modifikující enzymy, enzymy glycerolfosfolipidového metabolismu, UDP-galaktoso:ceramid galaktosylstranferasa, karbonická anhydrasa, 5′-nukleotidasa, 2′:3′- cyklická AMP fosfodiesterasa, Na,K-ATPasa MOG, myelin-oligodendrocyte glycoprotein; CNPase, 2′:3′- cyklická AMP fosfodiesterasa

18 Distribuce sodíkových a draslíkových kanálů myelinizovanýxh axonech.
20-40% myelin, 60-80% axon pochvy z otáček, tj. až dalších membrán  rm a  Cm Distribuce sodíkových a draslíkových kanálů myelinizovanýxh axonech. Sodíkové kanály jsou natěsnány v Ranvierových zářezech (zeleně) a draslíkové kanály (červeně) jsou roztroušeny v paranodální oblasti. Všimněte si, jak se axon v R.z. zužuje. cytoplasma Schw. buňky basální membrána cytoplasma glie astrocyt Ranv. zářez axon Periferní myelin rychleji vedoucí myelinizovaná vlákna umožní vznik složitějších živých organismů schopných rychlejší lokomoce apod. na nemyelinizovaném vlákně tekou ionty sodíku dovnitř a draslíku ven po celé délce vlákna, což může při dlouhodobější stimulaci vést ke změnám koncentračních poměrů (u myelinizovaných vláken se tak děje jen v Ranvierových zářezech); myelin navíc „drží“ Na+ IKs a pumpu v místě nodu u myelinizovaných vláken netřeba tolik energie na přečerpávání Na+/K+ (snížení spotřeby ATP)

19 Nemyelinizovaná vlákna
Rychlost vedení v myelinizovaných vláknech se pohybuje od několika m/s po víc než 100 m/s. Světový rekord drží myelinizované axony krevet, které vedou rychlostí až 200 m/s. Díky myelinizaci roste membránový odpor a klesá kapacita membrány (čím tenčí vrstva izolantu, tím větší kapacita, neboť jsou větší síly přitahující opačné náboje), čímž se postup vzruchu „nezdržuje“ nabíjením membrány, a navíc je vzruch veden tzv. saltatorně. U nemyelinizovaných vláken je jedinou cestou, jak zvýšit rychlost vedení, zvýšit průměr vlákna, a tím snížit vnitřní odpor axoplasmy ri: ri závisí na průměru vlákna (ri = Ri / pa2). Rychlost vedení RV v nemyelinizovaných vláknech je přímo úměrná druhé odmocnině z axiálního (podélného) odporu vlákna ri a tím i druhé odmocnině z průměru vlákna D (D... diameter): RV D Nemyelinizovaná vlákna RV = k . ri Rychlost vedení zruchů vs. průměr vlákna RV… rychlost vedení D… průměr axonu resp. D RV 1 mm RV = k . D = D½ Tasaki I., J Integrative Neuroscience, Vol. 3, No. 2 (2004) 115–124 Rychlost vedení RV v myelinizovaných vláknech je přímo úměrná průměru vlákna D: RV D Myelinizovaná vlákna Obě se protnou v 1 ( 1mm)  nemyelinizovaná vlákna s průměrem pod 1 mm vedou rychleji, tj. vlákna s průměrem pod 1 mm jsou u obratlovců zásadně nemyelinizovaná RV = k . D k = 4,5 pro vlákna menší než 11 mm k = 6 pro vlákna větší než 6 mm

20 Experimentální hodnoty rychlosti vedení v savčím myelinizovaním axonu , vynesené jako funkce průměru vlákna (podle Ruch and Patton, 1982)

21 +++ - - - Podstatou šíření akčního potenciálu (AP) jsou tzv. lokální proudy. Jde o toky iontu od místa vzruchu (AP). Směr toku může být antidromní (zpáteční) nebo orthodromní (dopředný); na vzrušivých membránách je podstatou propagace AP tok dopředný (membrána je v místech, kudy už AP prošel, dočasně nevzrušivá – specifické chování Na+ IKs). ( ) rm ri λ = Tyto lokální proudy protékat přes membránu. V meylinizovaných vláknech mohou ionty protékat skrze membránu jen v Ranvierových zářezech. V axoplasmě tedy dojde k přesunu iontů směrem od místa vzruchu, ale extracelulárně se to může projevit jen v neizolované části – zářezu. Tam dojde k odpovídajícímu toku iontů přes membránu, a tedy k depolarizaci membrány. Akční potenciál „přeskočí“ izolovanou oblast a stejným způsobem se šíří k dalšímu zářezu. Není třeba otevírat kanály po celé délce membrány vlákna. Tomuto způsobu propagace AP se říká saltatorní vedení. Vzdálenost, do které tyto lokální proudy „doběhnou“, závisí na délkové konstantě. Čím vyšší odpor membrány, tím dále se lokální proudy rozšíří s rozumnou amplitudou. I to má své limity: při přílišné myelinizaci by začal převažovat negativní vliv ri a snižování kapacity membrány. Ideální poměr axon : pochva je 0,7. - největší vlákna v lidském těle mají průměr okolo 20 mm - vlákno hlavonožce o průměru 0,5—1,0 mm – 20 m/s - vlákno obratlovce o průměru 20 mm – 120 m/s  plocha tohoto vlákna by se vešla do průřezu vlákna hlavonožce 2500x

22 Při akčním potenciálu šířícím se podél vlákna o průměru 12 mm by dovnitř vlákna vtekla až 3% sodných iontů v blízkosti membrány. Tím by byla neúnosně zatížena Na+/K+ ATPasa, pokud by se tak dělo podél celé délky vlákna. Běžná transportní kapacita Na+/K+ ATPasy je asi 200 iontů Na+ přenesených za sekundu z buňky. Ačkoli tento enzym pracuje za běžných okolností v dolní části svých možností, při rychlé a dlouhé salvě APs by takový tok iontů nezvládl. Proto se tak děje jen na malé ploše membrány v Ranvierových zářezech, kde je Na+/K+ ATPasa silně akumulována. Sodné ionty se také pufrují tím, že jsou transportovány axoplasmou mezi nody. Bezobratlí využívají faktu, že povrch roste s první mocninou poloměru, zatímco objem s druhou. Vlákna s velkým průměrem mají velký objem. Takže ačkoliv axon o průměru 600 mm může mít koncentraci sodíkových kanálů až 500 na 1mm2 sarkolemy, při akčním potenciálu vteče dovnitř vlákna podél celé jeho membrány sice mnoho sodných iontů, ale vzhledem k objemu axoplasmy to představuje zvýšení intracelulární koncentrace Na+ o jen asi 0,01% . Myelinizace zvyšuje rychlost vedení myelinizovaných vláken obratlovců několika způsoby: prodlužuje délkovou konstantu a tím pasivní elektrotonické šíření lokálních proudů zvyšuje amplitudy lokálních proudů v místě Ranvierových zářezů napomáhá pufrování vtoku a výtoku iontů v paranodiích (která mohou být díky silné vrstvě myelinu a tím vyšší délkové konstantě poměrně dlouhá)

23 Podstata biopotenciálů
Klidový membránový potenciál (KMP) vzniká zejména díky  nerovnoměrné distribuci iontů na membráně  selektivní propustnosti membrány pro daný ion 117 Na+ 3 K+ 120 Cl- 0 A- 12 108 4 116 + - -60 mV vně buňky uvnitř buňky Vnitřek buňky je sice elektricky neutrální – stejný počet kladných i záporných nábojů, ALE VZHEDEM K VNĚJŠKU JE elektricky záporný. Na této polaritě se podílí hlavně záporně nabité molekuly, které nemohou volně procházet membránou a jsou drženy uvnitř buňky (ATP,CP, isothionát, záporně nabité zbytky postranních aminokyselin proteinů aj.). Nerovnoměrná distribuce iontů na membráně je udržována zejména  AKTIVNÍM TRANSPORTEM Na+ z buňky  SOUČASNÝM TRANSPORTEM K+ DOVNITŘ BUŇKY (uvnitř buňky je draslíku asi 20-70x více než extracelulárně)

24 [xi]II mi = RT ln + nFD [xi]I ~ EK+ = [K+]out [K+]in RT nF ln ~
Na rozhraní se ustaví elektrochemický potenciál mi, jehož velikost je určena dvěma členy. První, logaritmický člen, je odvozen z difusní (osmotické) práce, druhý představuje práci elektrickou, přesun určitého množství nábojů z jednoho do druhého roztoku. mi = RT ln nFD [xi]II [xi]I ~ [xi] je koncentrace (obecného) iontu xi v roztocích I a II, F je Faradayova konstanta (náboj jednoho molu elektronů , asi 96 000 coulombů/mol), a n (nebo někdy z) je valence iontu (např. n=+1 pro K+ a –1 pro Cl-).  je tedy potenciál(ový rozdíl) mezi vnitřkem a vnějškem buňky, za stavu, kdy přes membránu neteče žádný difusní proud. Říká se mu též ROVNOVÁŽNÝ POTENCIÁL, Nernstovský rovnovážný potenciál (s patřičným indexem pro ten který iont: K+ ionty  EK+). EK+ = [K+]out [K+]in RT nF ln

25  Proč se tedy živá buňka tolik namáhá, aby si udržela nějaký MP?
 Naměřili bystě membránový potenciál (MP) u každé živé buňky, nebo jen na membráně buněk vzrušivých? MP má každá živá buňka, i když různě vysoký. Zdravé svalové vlákno kosterní svaloviny má typický klidový MP okolo –70 mV, ale jsou buňky s KMP daleko nižším - třeba buňky střevního epitelu mají KMP i okolo –15 mV. Každá živá buňka si udržuje nějaký MP, tedy nerovnoměrnou distribuci iontů vně a uvnitř. To není snadné, ionty musí být různě přečerpávány (některé do buňky, jiné ven), což je energeticky ohromně náročné a nevýhodné. Svalové vlákno může za určitých podmínek až polovinu vyrobeného ATP spotřebovat na činnost transportních pump, zejména Na+/K+ ATPasy – jiným slovy na udržení svého MP v nějakých rozumných mezích. To je hodně drahý špás, když si uvědomíte, jak důležitá molekula ATP je.  Proč se tedy živá buňka tolik namáhá, aby si udržela nějaký MP? Pamatujte si, že s nerovnoměrnou distribucí jakýchkoliv látek, ať už nenabitých nebo iontů, je vždycky spojen určitý gradient: látek (koncentrační), náboje apod. Velmi hrubě řečeno, každý gradient je spojen s určitým obsahem energie, s nějakou energetickou informací, každý gradient vzdaluje živý systém od stavu termodynamické rovnováhy. Termodynamická rovnováha je stav neslučitelný se životem, a proto se jí buňka brání. Energii „uloženou“ v nějakém gradientu může pak buňka využívat různě – na transport látek, na syntézu apod. Pamatujte si tedy klíčový poznatek: jakýkoliv gradient oddaluje živý systém od stavu termodynamické rovnováhy a nese s sebou určitý energetický a informační obsah.

26 ENa+  +66 mV EK+  -90 mV 1 y = (k) ln x y = ln x ENa+ = [Na+]out
[Na+]in RT nF ln Enějakého iontu 145 12  zlomek větší než 1  ENa+ leží v kladných hodnotách ENa+  +66 mV 4 155  zlomek menší než 1  EK+ leží v záporných hodnotách EK+  -90 mV Rovnovážný potenciál Enějakého iontu lze také jinak charakterizovat jako potenciál, při němž neteče pasivně iontovými kanály žádný elektrický, zde tedy i difusní proud - ani z buňky, ani do buňky. Někdy se také označuje jako potenciál reversní (Vr), protože na jeho úrovni se mění směr toku proudu přes membránu; v případě draslíku teče K+ proud ven při kladnějších hodnotách KMP než je EK, a dovnitř, jestliže buňku uměle „hyperpolarizujeme“ na zápornější potenciál než je Vr (ionty draslíku tekou naopak do buňky.)

27 Účast jednotlivých iontů na výsledném klidovém membránovém potenciálu (Em) je dána nejen  poměrem koncentrací, ale poměrem jejich propustností, což vyjadřuje komplexní Goldman-Hodgkin-Katzova rovnice, v níž jsou zavzaty  poměrné propustnosti P jednotlivých iontů, vztažené k PK = 1: PNa [Na+]o + PK [K+]o + PCl [Cl-]i PNa [Na+]i + PK [K+]i + PCl [Cl-]o Em = ln RT nF Em = 58 log PNa [Na+]o + PK [K+]o + PCl [Cl-]i PNa [Na+]i + PK [K+]i + PCl [Cl-]o nebo též Např. pro obří vlákna sépie jsou propustnosti pro Na+ (PNa=PNa/PK), K+ (PK=PK/PK) a Cl- (PCl=PCl/PK) následující: PK : PNa : PCl = 1 : 0,04 : 0,5 Je zřejmé, že klidová propustnost pro Na+ je zpravidla 25 (1:0,04) až 100 (1:0,01) nižší než pro K+ (jen nepatrný počet Na+ kanálů se v klidu náhodně otevírá). Pro Cl- je propustnost membrány obřího vlákna sépie asi poloviční. Propustnost = tok / elektrická a chemická hnací síla iontu (mM/cm2/sec; Vm-Ex)

28 Driving forces of ions = hnací síly iontů
Na ionty působí dvě zásadní síly, které ovlivňují jejich distribuci: síly elektrické, které je nutí pohybovat se ve směru jejich elektrického gradientu, a síly chemické, které je nutí pohybovat se ve směru jejich chemického gradientu. chem el. out in Na+ + + + - - - Cl- K+ tj x PK = x PNa = x PCl = 117 Na+ 3 K+ 120 Cl- 0 A- 12 108 4 116 + - -60 mV vně buňky uvnitř buňky Klidový mem. potenciál je výsledkem vtoku Na+, výtoku K+ a činnosti Na+/K+ ATPAsy. Proč ionty nedifundují přes membránu tak, aby se jejich koncentrace na obou stranách vyrovnaly (pomineme-li s výjimkou K+ nevalnou propustnost membrány)? Např. K+: ven by „chtěl“ po svém koncentračním gradientu. Když ale difunduje ven z buňky, na vnějším povrchu membrány se zvyšuje akumulace kladného náboje a na vnitřní akumulace náboje záporného. Roste transmembránové napětí. Tento elektrický gradient zpomalí výtok kladně nebitých iontů K+ z buňky, a když je gradient dostatečně velký, čistý tok K+ přes membránu se zastaví úplně. Ionty draslíku jdou v rovnováze. Jednotlivé ionty sem a tam občas procházejí, ale čistý tok K+ je nulový.

29 Ek AKČNÍ POTENCIÁL, intracelulárně snímaný skleněnou elektrodou ENa
Akční potenciál (AP, vzruch, impuls) je velký, krátký a neměnný signál ("vše nebo nic"), který se šíří podél nervu a dlouhých svalových vláken bez snížení amplitudy. PODSTATA: 1) otevření Na+ kanálů, pří depolarizaci na prahovou hodnotu (elektricky, chemicky, mechanicky). PNa převýší ostatní, Na+ teče dovnitř, Em na pár ms určen ENa+ (plus uvnitř - přestřelení) 2) Následné zvýšení PK : další K+ kanály se pod vlivem depolarizace otevřou a přetrvají po uzavření Na+ kanálů → vzniká následná hyperpolarizace. přestřelení následná hyperpolarizace lokální odpověď (nad)prahový puls KMP membránový potenciál proud práh ENa Ek

30 membránový potenciál (mV)
Akční potenciál vzniká postupným otevřením nejprve Na+ (někdy Ca2+) a pak K+ iontových kanálů, jestliže je klidový membránový potenciál náhle snížen zhruba po 15 mV (řekněme z -70 mV na -55 mV) na tzv. hodnotu prahové depolarizace. Při této prahové depolarizaci se otevírají napěťově citlivé Na+ kanály. Sodík vtéká po koncentračním spádu do buňky a snižuje negativní náboj vnitřku. Na vrcholu vlny se polarita uvnitř buňky otáčí na +20 či +30 mV (hodnota se blíží rovnovážnému potenciálu ENa = +50 mV). Tomuto obrácení polarity se také říká přestřelení - overshoot. Akční potenciál zdravého vlákna kosterní svaloviny a vlákna nervového je krátkodobý (1-3 ms) a regenerativní- depolarizace otevírá další Na+ kanály v sousední oblasti, čímž se vlna šíří. mS/cm2 membránový potenciál (mV) ENa EK

31 následná hyperpolarizace
ENa+= +66 mV EK+= -90 mV klidový MP = - 70 mV Membránový potenciál D 15 mV absolutní relativní refrakterní fáze 1-2 ms přestřelení Jednotlivé fáze AP práh následná hyperpolarizace

32 Trvání akčního potenciálu je určeno
a) spontánní inaktivací, tj. uzavřením Na+ kanálů – jejich inaktivací a b) opožděným otevřením napětím řízených K+ kanálů, které mají tendenci membránu repolarizovat. Po ukončení vlny akčního potenciálu se klidový membránový potenciál dočasně hyperpolarizuje v důsledku přetrvávající zvýšené propustnosti pro K+, což znamená, že po několik dalších milisekund je toto místo membrány nedráždivé (refrakterní fáze). Jakmile vznikne akční potenciál - jakožto vlna opačné polarity, než je v klidu -, vznikají mezi tímto místem a sousedními úseky membrány lokální proudy.

33 následná hyperpolarizace
K+ Na+ (C) klidový stav depolarizace repolarizace následná hyperpolarizace Em (mV) (B) K+ Na+ Na+ K+ (D) K+ Na+ sodíkový kanál membrána draslíkový vně buňky uvnitř buňky (A) Sodíkový a draslíkový kanál během AP

34  Proč vtéká vápník do buňky?
ms ENa+, + 66 mV EK+, -90 mV klidový MP, - 70 mV D15 mV 1 2 3 1-2 ms 4 Ca2+  Proč vtéká vápník do buňky? Fáze plató srdečního AP je podmíněna otevřením napěťově ovládaných vápníkových kanálů. Vápník teče po svém elektrochemickém gradientu do buňky a depolarizuje membránu po dobu až 200 ms. Během fáze plató jsou již uzavřeny sodíkové kanály. Tato fáze skončí uzavřením vápníkových kanálů, které vpouštějí vápník do srdečního svalu. Jak ale kardiomyocyt pozná, že už je ta správná doba na uzavření vápníkových kanálů? Vápníkové kanály zodpovědné za fázi plató srdeční svaloviny mají na své intracelulární straně dvě vazebná místa pro ionty vápníku. Poté, co jsou obě obsazena (signál: už je v cytoplasmě vápníku dost, uběhla dost dlouhá doba), kanály se autoregulačně uzavírají. Membránový potenciál klesá, otevírají se napěťově ovládané draslíkové kanály a AP končí způsobem, jaký známe ze svaloviny kosterní.

35 [K+]o  [Cl-]o = [K+]i  [Cl-]i
Konečné koncentrační složení na obou stranách membrány je řízeno, doladěno Donannovou rovnováhou. [Cl-]in [Cl-]out ECl = ln RT nF a protože valence chloridových aniontů je záporné číslo (z = -1), ECl = -58 log [Cl-]o/[C-]i neboli díky pravidlům logaritmování ECl = +58 log [Cl-]i/[Cl-]o. Při srovnatelně stejně vysokých propustnostech klidové membrány pro Cl- a K+ platí v ekvilibriu rovnost příspěvku obou iontů: [K+]out [K+]in ln RT F [Cl-]in [Cl-]out = ln Tato rovnice vyjadřuje rozdíl (membránových) potenciálů obou iontů, který je důsledkem vzniku elektrické dvojvrstvy na rozhraní obou roztoků s rozdílnými koncentracemi iontů. Z této rovnice vyplývá základní podmínka membránové rovnováhy: po zjednodušení dostáváme vztah známý jako Donnanova rovnováha [K+]o  [Cl-]o = [K+]i  [Cl-]i

36 Rovnovážné potenciály K+ i Cl- jsou shodné (poměr koncentrací 1:30).
Vliv změny extracelulární koncentrace iontů Modelová buňka: propustná pro K+ a Cl-, extra- a intracelulární prostředí je elektricky neutrální a v osmotické rovnováze. 114 Na+ 6 K+ 120 Cl- 0 A- 29 91 7,9 112,1 + - -68 mV; rel. obj. 1,035 vně buňky uvnitř buňky dvojnásobná [K+]out 117 Na+ 3 K+ 120 Cl- 0 A- 30 90 4 116 + - -85 mV vně buňky uvnitř buňky 114 Na+ 3 K+ 60 Cl- 60 A- 30,5 89,5 2,0 118,0 + - -85 mV; rel. obj. 0,98 vně buňky uvnitř buňky poloviční [Cl-]out Rovnovážné potenciály K+ i Cl- jsou shodné (poměr koncentrací 1:30). U neuronů a mnoha jiných typů buněk je klidový membránový potenciál citlivý na změny extracelulární koncentrace draselných iontů, ale ne chloridů. Proč?

37 3 mM NaCl byly nahrazeny 3 mM KCl (nezmění se osmolarita)
3 mM NaCl byly nahrazeny 3 mM KCl (nezmění se osmolarita). Vzrůst [K+]out sníží koncentrační gradient zodpovědný za výtok draslíku, ale elektrický gradient je zpočátku nezměněný. Dovnitř buňky začne vtékat draslík a snižovat záporný náboj na vnitřní straně membrány. Ta se depolarizuje a tím se změní rovnovážný potenciál pro chloridy. Chloridy začnou také vtékat do buňky. Tento vtok trvá až do doby, než se ustanoví nová rovnováha iontů a nový membránový potenciál. Díky vtoku vody se zvětší objem buňky o 3,5%. 114 Na+ 6 K+ 120 Cl- 0 A- 29 91 7,9 112,1 + - -68 mV; rel. obj. 1,035 vně buňky uvnitř buňky dvojnásobná [K+]out K+ i Cl- vyteče stejné množství, ale výsledná změna koncentrace vypadá vyšší pro chloridy. Není to tak. Trik je ve změně objemu buňky. Kdyby zůstal stejný, byla by konečná koncentrace Cl- 8,2 (7,9) mM, ale K+ 94,2 (91,0)mM. 60 mM chloridů bylo nahrazeno 60 mM membránou neprocházejícího aniontu (nezmění se osmolarita). Pokles [Cl-]out zvýší koncentrační gradient zodpovědný za výtok chloridů, ale elektrický gradient je zpočátku nezměněný. Chloridy vytékají z buňky a membrána se depolarizuje. Draselné ionty tím už také nejsou v rovnováze a začnou rovněž opouštět buňku. Draslíku i chloridů vyteče z buňky stejné množství, ale vzhledem k původní vysoké [K+]in je koncentrační změna draslíku vcelku zanedbatelná. Proto se membránový potenciál vrátí víceméně zase ke své původní hodnotě. 114 Na+ 3 K+ 60 Cl- 60 A- 30,5 89,5 2,0 118,0 + - -85 mV; rel. obj. 0,98 vně buňky uvnitř buňky poloviční [Cl-]out

38 Co si pamatovat z dnešní přednášky
délková konstanta (definice) vstupní odpor membrány, specifický odpor membrány a axoplasmy význam časové a délkové konstanty myelinizace: stavba myelinu, k čemu to je rychlost vedení v ne- a myelinizovaných vláknech lokální proudy a saltatorní vedení Nernstův potenciál a (klidový) membránový potenciál propustnosti iontů Donnanova rovnováha změny extracelulárních koncentrací iontů a membránový potenciál