Biotechnologie Rostlinné biotechnologie – farmaceutické produkty

Prezentace na téma: "Biotechnologie Rostlinné biotechnologie – farmaceutické produkty"— Transkript prezentace:

1 Biotechnologie Rostlinné biotechnologie – farmaceutické produkty
Marek Petřivalský Katedra biochemie PřF UP

2 Rostlinná biotechnologie molecular farming/pharming

3 „Molekulární farmaření“
aplikace metod molekulární biologie ve výrobě komerčních produktů v rostlinách a) produkty rostlinám vlastní lipidy, sacharidy, proteiny produkty sekundárního metabolismu b) produkty „cizího“ původu proteiny farmaceutika - protilátky, vakcíny bioplasty

4 Přehled sacharidů Polysacharidy celuloza škrob cyklodextriny fruktany
oligofruktany Polysacharidy celuloza škrob cyklodextriny fruktany pinitol manitol trehalosa cyklodextrin

5 Biosyntéza sacharidů vakuola cytosol plastid Trehalosa Cyklodextiny
Sacharosa Fruktany Manitol myo-inositol Pinitol UDP-glukosa Glukosa-1-fosfát Glukosa-6-fosfát Fruktosa-6-fosfát Triosafosfát Glykolýza Trehalosa Cyklodextiny ADP-glukosa Hexosafosfát CO2 Škrob Amylopektin Amylosa Modifikovaný škrob plastid

6 ŠKROB Produkce škrobu v rostlinách 30% potrava a krmiva
70% průmyslová výroba Za normálních podmínek: 20-30 % amylosa (lineární: po ochlazení krystaluje) 70-80% amylopektin (větvený: hůře stravitelný)

7 ŠKROB více amylopektinu výhodné pro zpracování potravin
inhibice enzymu GBS1 („granule-bound starch synthase) „amylose-free“ brambory 2) více amylosy výhodné pro průmyslové použití inhibice enzymu SBE („starch-branching enzyme“) „high-amylose“ škrob z brambor

8 Cyklodextriny 6-8členné kruhy glukopyranosy
hydrofobní kapsa pro rozpouštění hydrofobních farmak (steroidy ...) Výroba cyklodextrinů: a) biotechnologie bakteriální fermentace kukuřičného škrobu b) možnost transgenních brambor cyklodextringlykosyltransferasa (Klebsiella sp.) - plastid malá konverze škrobu - pouze 0,01-0,001% nedostupnost nerozpustných granulí pro enzym?

9 Polyfruktany rozpustné polymery fruktosy uložené ve vakuole
opakování struktury (G-F-Fn) inulin (cibule, topinambura, čekanka) levany (stonky a listy trav)

10 Transgenní rostliny a) tabák (bakteriální enzymy) - hromadění fruktanů
levansukrasa (B. subtilis) fruktosyltransferasa (Streptomyces spp.) b) brambory přesměrování spotřeby sacharózy na úkor škrobu levansukrasa (Erwinia amylovora) 12-19% fruktany x snížený výnos hlíz bramboru c) kukuřice gen z B. amyloliquifaciens F any mg/g semene d) cukrová řepa - gen SST z topinambury „sacharosa-sacharosa fructosyltransferasa“ - oligofruktany „ fruktanová řepa“ - nízkokalorická sladidla, probiotika

11 Metabolické inženýrství rostlinných lipidů
Kys. palmitová (16:0) Kys. stearová (18:0) Kys. olejová (18:1) Kys. linolová (18:2) Kys. a-linoleová (18:3) Kys. eruková (22:1) Metabolické inženýrství rostlinných lipidů úprava přirozených lipidů syntéza nových látek

12 Úpravy vlastností lipidů
1) mastné kyseliny s kratším řetězcem (kosmetika …) kys. laurová 12:0 (přirozeně kokos a palmy) gen pro acylACP thioesterasu v řepce olejné 2) mastné kyseliny s delším řetězcem (průmyslové oleje) kys. eruková 22:113 : HEAR (high-erucic acid rape) zvýšená exprese genu pro elongasu zatím nemůže soutěžit s minerálními oleji 3) stupeň nasycení (požadavek uniformity lipidů pro průmysl) zvýšený obsah kys.stearové 18:0 - inhibice desaturasy zvýšený obsah kys. olejové 18:1 - inhibice desaturasy řepka olejná , soja x odolnost na chlad

13 Výroba speciálních MK 4) výroba speciálních MK
v rostlinách známo 210 různých mastných kyselin a) kys.petroselenová 18:16 : Umbelliferae (koriandr) oxidací 03 = kys. laurová a adipová - výroba nylonu tabák transformovaný genem pro desaturasu z koriandru

14 Výroba speciálních MK b) kys. linolenová (18:36,9,12)
(12 hydroxyolejová) - skočec obecný kys. arachidonová (20:45,8,11,14 ) esenciální MK a prekursory eikosanoidů transformace tabáku - mikrosomální desaturasy genem z brutnáku (6 -desaturasa) genem z houby Mortierella alpina (5 -desaturasa) kys. rikolenová“ - enzym hydroxylasa klonována

15 zdroj ricinového oleje
Skočec obecný zdroj ricinového oleje

16 Bioplasty biodegradovatelné polymery
zatím vyráběné mikrobiální biotechnologí PAH = polyhydroxyalkanoáty PHB = polyhydroxybutyrát polyhydroxyalkanoát polyhydroxybutyrát

17 Biosyntéza PHB biosyntéza PHB v baktérii Alcaligenes eutrophus
Acetyl-CoA Acetoacetyl-CoA 3-hydroxybutyrát-CoA Polyhydroxybutyrát 3-ketothiolasa Acetoacetyl-CoA reduktasa PHB synthasa Biosyntéza PHB biosyntéza PHB v baktérii Alcaligenes eutrophus vychází z acetyl-CoA

18 PHB v Arabidopsis klonovány geny pro tři klíčové enzymy
transformovány do Arabidopsis nejlepší výsledky při přenosu do chloroplastu PHB: 40% DW v plastidu x poruchy růstu

19 PHB v Arabidopsis plastid cytosol acetyl-CoA malonyl-CoA
acetoacetyl-CoA 3-hydroxybutyryl-CoA PHB isoprenoidy flavonoidy (phaC) plastid (phaB) cytosol acetyl-CoA lipidy

20 PHB v Arabidopsis plastid cytosol acetyl-CoA malonyl-CoA
acetoacetyl-CoA 3-hydroxybutyryl-CoA PHB isoprenoidy flavonoidy (phaC) plastid (phaB) cytosol lipidy (phaA)

21 kumulovaný v chloroplastech
Polymer PHB kumulovaný v chloroplastech

22 Polymer PHA PHA (polyhydroxyalkanoát) kopolymer, delší řetězce
méně krystaluje, elasticita akumulace v Pseudomonas růst na kyselém substrátu Transgenní Arabidopsis gen pro phaC1 z P. aeruginosa akumulace PHA v glyoxisomech a peroxisomech v množství 4 mg/g DW

23 „Molekulární farmaření“
Výroba vína

24 Molekulární pěstování proteinů
principiálně teoreticky snadné problémy: správné složení, post-translační úpravy, snadnost purifikace, ekonomická výhodnost 1) Enzymy pro průmyslové a zemědělské použití 2) Farmaceutické přípravky a) protilátky - imunoglobuliny, řetězce Ab b) podjednotky vakcín c) proteinová antibiotika

25 Produkce hirudinu v olejových tělískách řepky (Brassica napus)
Struktura transgenu vloženého do B. napus v olejových tělískách řepky (Brassica napus) jako fúzní protein s oleosinem ve finálním kroku štěpení proteasou

26 Produkce hirudinu Struktura transgenu vloženého do B. napus
Oleosin promotor Oleosin fúzní protein kodující sekvence terminátor exprese v transgenní rostlině do olejových tělísek rostlina B. napus homogenizace rostlinný materiál centrifugace tuková tělíska rostlinný drť přenos do čisté zkumavky štěpení proteasami tuková tělíska na povrchu protein v rozpustné fázi Oleosin protein proteasové rozpoznávací místo

27 Produkce enzymů pro průmyslové použití
Avidin Diagnostika Glukurodinasa Trypsin Farmaceutika, dermatologie Celulasa Výroba EtOH z celulózy Termostabilní xylanasa Zpracování biomasy Fytasa Rozklad fytátu Amylasa Potravinářství Ligninperoxidasa Zpracování papíru

28 Produkce enzymů ProdiGene Inc 1998 první komerční enzym TrypZeanTM
rekombinantní trypsin AproliZeanTM rekombinantní aprotinin

29 myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakis dihydrogen ortofosfát
Příklad: fytasa Fytasa fytát inositolmonofosfát inositol myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakis dihydrogen ortofosfát

30 Příklad: fytasa Fytát hexafosfát inositolu
nestravitelný pro zvířata s jednoduchým žaludkem vysoký obsah v semenech - krmivo pro zvířata vylučování ve výkalech - znečištování fosforem Fytáza zvýšený příjem fosfátu a snížená kontaminace prostředí transgenní kukuřice (Čína), ječmen (ČR)

31 Protilátky produkované v rostlinách Fv fragment jednoduchý řetězec
místo vazby antigenu IgG - imunoglobulin scFv jednořetězcový fragment vzniklý spojením lehkého a těžkého řetězce variabilní části IgG lehký řetězec IgG těžký řetězec Fv fragment jednoduchý řetězec

32 Protilátky produkované v rostlinách
S. mutans (zubní kaz) tabák sIgA IgG Nádor střeva Herples simplex virus soja Jednořetězové fragmenty Lymfoma scFV (38C13) Karcinoembryonní antigen obilniny scFvT84.66

33 Protilátky „na zakázku“
syntéza sekreční protilátky IgA v transgenní rostlině syntéza funkční IgA byla dosažena postupným křížením transgenů pro jednotlivé řetězce

34 „Molekulární farmaření“

35 Vakcíny produkované v rostlinách
Lidské E.coli enterotoxin B tabák 0,001% SLP V. cholerae CtoxB podjednotka brambor 0,3% TSP Hepatitis B pláštový protein 0,1% FW Norwalk vir protein kapsidu 0,23% TSP vzteklina glykoprotein rajče 1% TSP Zvířecí kulhavka epitope VP1 vojtěška koronavirus kukuřice parvovirus VP2 protein Arabidopsis 3% SLP

36 Vakcíny Prof. Charles Arntzen
transgenní rajčata obsahující Norwalk virus antigen „jedlá“ vakcína z rajčat

37 „Vakcíny budoucnosti“
Zrna transgenní kukuřice obsah dávky 1mg B-podjednotky toxinu E.coli Kukuřičný „snack“ připravený ze stejného množství zrn Frakce získaná z kukuřičných zrn koncentrace antigenu cca 6x vyšší „Vakcíny budoucnosti“

38 Biofarmaceutika produkovaná v rostlinách
Somatotropin Human Tabák - Interferon Rýže, tabák Serový albumin -Antitrypsin Rýže Laktoferrin Brambor Aprotinin Kukuřice Enkefalin Arabidopsis Hirudin H. medicinalis T. kirilowii Trichosantin

39 Trichosanthes kirilowii
Biofarmaceutika Pijavice - Hirudo medicinalis Trichosanthes kirilowii