Viry a jejich strategie 6.1 Úvod 6.2 Bakteriofág lambda 6.3 Virus chřipky 6.4 HIV.

Prezentace na téma: "Viry a jejich strategie 6.1 Úvod 6.2 Bakteriofág lambda 6.3 Virus chřipky 6.4 HIV."— Transkript prezentace:

1 Viry a jejich strategie 6.1 Úvod 6.2 Bakteriofág lambda 6.3 Virus chřipky 6.4 HIV

2 5.1 Úvod - definice viru Virus = buněčný parazit Virion = virus mimo buňky, inertní částice Virion = kapsida (= strukturní protein[y]) + genom + (enzymy) + (membránový obal) Genom = 1 typ NA (DNA nebo RNA), ssNA x dsNA, kružnicový x lineární Virus využívá enzymatického aparátu buňky k reprodukci: A) Nikdy nekóduje vlastní translační aparát B) Nikdy nekóduje enzymy drah energetického metabolizmu Význam virů: nemoci, výzkum buněk, genové inženýrství/terapie

3 Rozdělení virů 1)Podle hostitele (živočišné, rostlinné, bakteriální) 2)Podle replikační strategie: DNA viry (DNA → DNA): ssDNA, dsDNA RNA viry (RNA → RNA): +RNA, -RNA, dsRNA Retroviry (RNA → DNA → RNA) 3) Obalené x neobalené Evoluční původ virů Nejistý. Dokonce je možný různý původ různých skupin. 1)Redukce buněčných parazitů 2)Buněčné RNA/DNA ("osvobozený plasmid") 3)Katalytické autoreplikující se RNA (relikt RNA světa)

4 Virová částice Kapsida (kapsomera = strukturní jednotka): 1)ikosaedrální 2)helikální 3)pleiomorfní 4)komplexní Skupiny virů napadající člověka

5 Interakce viru s hostitelem 1)Vstup do buňky (endocytóza, fúze, poraněná buňka) 2)Lytický cyklus/Chronická infekce/Latence

6 Virové strategie Vysoká mutabilita (zejména RNA viry) Tlak na malou velikost genomu Nutnost zajistit celý replikační cyklus Využití buněčných struktur Poměrně zajímavé strategie na molekulární úrovni Virové "triky" při translaci

7 6.2 Bakteriofág lambda Napadá E. coli Ikosahedrální hlavička (2 druhy proteinů) Nekontraktilní ocásek + tenké vlákno na konci Genom: lineární dsDNA (47 kbp), kohezní konce (cos sekvence) Počátek infekce: 1) Adsorbce na buňku (přes malB - transportér maltózy) 2) Cirkularizace genomu (cos místa, buněčná ligáza) 3) Genová exprese (velmi časné a časné geny) 4) Replikace 5) Výběr reprodukční strategie Souvislosti: Genové inženýrství

8 Dvě různé životní strategie Lytický cyklus: Syntéza virových proteinů Tvorba virových částic Lyze buňky Lysogenie (profág): Integrace do genomu (bakterie se dělí) Stres - aktivace Vystřižení z genomu pak lytický cyklus

9 Lytická dráha Pokud nemá buňka dostatek živin Zastavení replikačního cyklu (příslušné proteiny nejsou exprimovány) Integrace fágovy DNA do bakteriálního genomu = profág Bakterie s profágem je imunní vůči infekci stejným druhem fága Reaktivace: při poškození DNA (stres), vystřižení λ genomu, lytický cyklus Souvislosti: DNA Lysogenní dráha Pokud má buňka dostatek živin Replikace Vznikají konkatemery - ty se štěpí na jednotlivé genomy O protein = analog DnaA, P protein = analog DnaC Exprese genů pro virovou částici a lyzi buňky

10 Cro a CI: dva hlavní hráči Cro represor a CI (λ represor): váží specifické DNA sekvence Cro = lytický cyklus, CI = lysogenní cyklus Represorový systém λ fága: CI-OR3-OR2-OR1-Cro (OR - operátor) Vazba CI do OR1 → represe transkripce Cro, vyšší afinita pro vazbu dalšího CI do OR2 Vazba CI do OR2 → represe transkripce Cro Vazba CI do OR3 (pouze vysoké koncentrace CI) → represe transkripce CI Vazba Cro do OR3 → represe transkripce CI Cro represor Promotor P RM Promotor P R

11 Genová exprese Velmi časné x časné x pozdní lytické x pozdní lysogenní Regulace genové exprese: 1)aktivace iniciace transkripce (CII) 2)represe iniciace transkripce (CI, Cro) 3)antiterminace transkripce (N, Q) 4)antisense RNA (protisměrná transkripce) (anti-Cre, anti-Q) 5) 3´ koncová mRNA degradace (Sib sekvence) PromotorProduktyRegulace iniciaceRegulace terminace PLPL N, CIII, xis-int-sibCIN PRPR Cro, CII, O, P, QCIN PR´PR´lýze, hlava, ocasQ PIPI intCII P RM CICro P AQ anti-Q RNACII P RE anti-Cro RNA, CICII

12 Genom bakteriofága λ attP = místo integrace Sib = RNA vlásenka signál pro 3´ koncovou degradaci

13 Integrace do bakteriálního genomu Lysogenie - virus ve formě profága Místně specifická konzervativní rekombinace int = integráza xis = regulátor integrázy Integrací do genomu se přeruší regulační sekvence sib Situace: xis > int (lytický cyklus, sib) nic xis < int (exprese CII - exprese int z P I ): integrace xis = int (reaktivace, není sib): vyštěpení Souvislosti: DNA - Rekombinace

14 pLpRpR´pIpAQpRMpRE Velmi časné geny CroN Časné geny O P Q CII CIII xis int Represe iniciace Antiterminace Rozhodnutí o lytickém cyklu Buněčné proteázy Sib sekvence: RNáza III degraduje od 3´ konce xis > int, neintegrace head tail lyze Antiterminace Replikace genomu Assembly virionů Lyze buňky Lytická dráha

15 pLpRpR´pIpAQpRMpRE Velmi časné geny CroN Časné geny O P Q CII CIII xis int Represe iniciace Antiterminace Lysogenní dráha Rozhodnutí o lysogenii aQ a Cro Iniciace transkripce vazba antisense RNA CI int int > xis integrace STOP reprodukce Integrace Exprese pouze CI Represe iniciace

16 pLpRpR´pIpAQpRMpRE CroN O P Q CII CIII xis int Represe iniciace Antiterminace Reaktivace viru CI DNA poškození SOS response Represe iniciace auto- proteolýza RecA* CI štěpení Excise Lytický cyklus xis = int, excise Chybí sib sekvence Nestabilní při SOS response head tail lyze Antiterminace

17 *Transdukce Horizontální přenos genetické informace virem 2 možnosti 1) Specializovaná: Po reaktivaci viru (proběhla lysogenie) Chybné vystřižení, okolí inzerce 2) Obecná: Nezávislé na integraci Zabalení buněčné DNA

18 5.3 Influenza virus Virus chřipky Hostitelé: obratlovci 3 rody: A, B, C (A - pandemie, ptačí chřipka) Genom: [-] RNA, segmentovaný (8 molekul), 13.5 kb Kóduje 10 proteinů Obalený: hemagglutinin (vstup), neuraminidáza (výstup) Obsah virové partikule: genom + replikáza + akcesorické proteiny Mutabilita replikázy (RNA dep. RNA pol.): 10 -4 Buňka nelyzuje, ale stejně umírá (šok) Napadá epithely dých. soustavy Označení kmenů podle typů HA a NA molekul Dnes nejčastější: H1N1, H3N2 Pandemie: H2N2 (?), H1N1, H2N2, H3N2

19 Proteiny viru chřipky

20 Replikační cyklus Trvá cca 6 hodin 1) HA - se váže na sialovou kyselinu glykoproteinů epithelu 2) Endocytóza - acidifikace (M2) - fúze membrán - uvolnění viru 3) [-]RNA s proteiny putuje do jádra (výjimka mezi RNA viry) 4) Syntéza [+]RNA vlákna 5) Genová exprese: A) obalové proteiny - sekreční dráha B) replikační proteiny - jádro (NP, PB1, PB2...) C) útok na buňku (NS1, stop translace, protivirová obrana) 6) Shluky HA a NA - assembly genomu + proteinů 7) Pučení viru, odštěpení sialové kyseliny (NA), uvolnění viru

21 Specifika reprodukce Závislý na buněčné DNA (replikaci) "Dekapitace" buněčných mRNA (PB2) Hlava (+ cca 20 nt) slouží jako primer pro transkriptázu PB1 Dva druhy [+]RNA: mRNA (cap + tail) a cRNA (replikace, neupravené konce) NP reguluje poměr cRNA/mRNA, když ↑NP, ↓mRNA

22 Replikační cyklus - ilustrace

23 *Imunizace (očkování) 1)Aktivní imunizace Neinfekční (oslabený vyšlechtěný nebo gen. modifikovaný) patogen 2) Genetická imunizace (nový typ AI) Podání expresního vektoru nesoucího gen pro antigen 3) Pasivní imunizace Podání protilátek (matka/plod, hadí uštknutí) Protilátka (imunoglobulin) = protein produkovaný B lymfocyty Mohutné přestavby genu pro Ig → specifita Vazba antigenu - neutralizace + signál pro další složky IS Genetická imunizace

24 Interakce s IS hostitele Hemagglutinin a neuraminidáza (povrch) jsou cílem terapie i IS Mutabilita: mění povrchové vlastnosti Antigenní drift: bodová mutace, změna epitopu Antigenní shift: současné napadení buňky 2 kmeny viru, výměna Protilátky proti HA - nejúčinnější Protilátky proti NA - méně učinné Protilátky proti nukleoproteinu - neúčinné

25 Mezidruhová bariéra Bariéra mezi ptačím a lidským virem (HA) Ptačí viry jsou nejvariabilnější (rezervoár) Ptačí původ měla většina pandemií Prasata - mohou být napadena lidským i ptačím virem

26 6.4 Human immunodeficiency virus AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) Objeven 1983 HIV1 (Pan troglodytes troglodytes, Šimpanz čego) HIV2 (Cercocebus atys, Mangabej bělokrký) Napadá buňky IS: CD4 + T lymfocyty (T4), makrofágy (tropismus) - mutace Genom: 2 x [+]RNA, 10 kb, 9 genů Retrovirus (RNA→DNA) Obalený (gp120, gp140) Mutabilita: 3 x 10 -5 Nobelova cena 2008

27 Replikační cyklus 1) Adsorbce na receptor + koreceptor 2) Fúze obalu s membránou buňky 3) Reverzní transkripce (ssRNA → dsDNA) 4) Transport dsDNA do jádra, integrace 5) Na viru nezávislá aktivace buňky (nutná pro replikaci viru), TF: NF-κB 6) Transkripce, translace a processing proteinů 7) Transkripce genomové RNA 8) Organizace nezralých nukleokapsid (gag, gag-pol, 2x RNA, tRNA) 9) Pučení virionů, maturace (rozstříhání polyproteinu) 10) Lyze buňky (jen T4)

28 Genom HIV LTR: Regulační sekvence U3,R,U5 Gag: Strukturní p. kapsidy Pol: Replikace Env: Obal Tat: Transkripce Rev: Transport a regulace mRNA Vpr: Transport DNA do jádra Vpu: Pučení virionů, superinfekce Nef: Brání superinfekci Vif (blok deaminace) Ve virionu 2 molekuly RNA (pseudodiploidní, 1 DNA) ve vazbě s tRNA (primer) Běžné retroviry: pouze Gag, Pol, Env

29 Vstup do buňky Receptor: CD4 Koreceptor: CCR5 u M, CXCR4 u T4 Env: V3 sekvence zodpovědná za tropismus T-tropní viry: fúze nakažené buňky s jinou T4

30 Replikace genomu Reverzní transkriptáza: RNA dep. DNA pol. DNA dep. DNA pol RNáza H PP: polypurinová sekvence

31 Integrace Integráza (z polyproteinu Pol) 1.Štěpení 2. Ligace Vznik přímých repetic (okolo místa inzerce) Místně specifická transpoziční rekombinace Náhodné místo v genomu (specificita se vztahuje k cDNA viru) Souvislosti: DNA - Rekombinace

32 Transkripce LTR U3: Promotor, enhancery, start R: Polyadenylační signál Transkripční interference, pouze levý promotor je funkční RNA pol. II (cap, poly(A)) Jediný transkript

33 Regulace sestřihu mRNA 1) Vícenásobný sestřih → Rev protein 2) Rev protein stabilizuje ne zcela sestřižené mRNA A) Jednoduše sestřižené mRNA B) Nesestřižené mRNA (genomové)

34 Genová exprese: triky Frameshift (posun čtecího rámce): Gag nebo Gag-Pol Alternativní sestřih Překrývající se geny Polyproteiny Posttranslační štěpení

35 Vliv na hostitele Napadá klíčové buňky imunitního systému (T4): problém T4 buňky umírají: A)Následkem replikace viru B)Apoptoticky (programovanou smrtí) C)Vlivem T8 cytotoxických lymfocytů Zdravotní následky: 1)Suprese imunity: oportunistické infekce, nádory 2)Poškození mozku (demence), makrofágy Souvislosti: Buněčný cyklus Souvislosti: Buněčná signalizace

36 Průběh infekce Rezistence: Mutace v genu pro koreceptor CCR5-Δ32 (5 - 14 % Evropanů) 1 alela - zpoždění cca o 2 roky, 2 alely silná rezistence, není neg. efekt Akutní fáze (připomíná chřipku): ↑↑HIV, ↓↓T4 Latentní fáze: ↓HIV, ↑T4, ↑ protilátky/T8 - stagnace AIDS: ↑HIV, ↓T4, ↓ protilátky/T8

37 Léčba Mutabilita → rezistence, proto kombinovaná léčba HAART: highly active antiretroviral therapy A) Inhibitory reverzní transkriptázy B) inhibitory proteázy Inhibitor proteázy: reakce

38 Shrnutí Vir = nebuněčná částice, reprodukující se v buňce Základní dělení virů: DNA, RNA, retro Existuje mnoho různých virových strategií Modelové viry (patogeny, E. coli) Virus je vázán na omezený okruh hostitelů Využití buněčných procesů/struktur pro svůj prospěch