Chromatografické metody Zdeněk Glatz. Podstata „Při chromatografii dochází k neustálému vytváření rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze –

Prezentace na téma: "Chromatografické metody Zdeněk Glatz. Podstata „Při chromatografii dochází k neustálému vytváření rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze –"— Transkript prezentace:

1 Chromatografické metody Zdeněk Glatz

2 Podstata „Při chromatografii dochází k neustálému vytváření rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze – stacionární a mobilní.“

3 Chromatografie

4 Mobilní fáze - kapalina – LC plyn – GC Eluce - Izokratická – stejná eluční síla Gradientová – rostoucí eluční síla Použití - analytická preparativní

5 Kapalinová chromatografie LC Mobilní fáze-kapalina Stacionární fáze-pevná fáze, kapalina

6 Provedení LC Papírová PC Tenkovrstvá TLC Kolonová CC

7 Teoretické aspekty chromatografie

8 Teorie „Ideální lineární chromatografie“ Martin, Synge

9 Teorie „Ideální lineární chromatografie“ 1.Nekonečně rychlé ustavení rovnovah 2.Pístový tok mobilní fáze 3.Nulová difuse 4.Lineární sorpční isoterma

10 Chromatografie

11 Chromatogram VmVm Vr’Vr’ VrVr

12 Retenční – eluční čas t r Doba od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky Retenční – eluční objem V r Objem mobilní fáze proteklý od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky F m – objemová rychlost mobilní fáze

13 Mrtvý objem V r – zdánlivý retenční objem V r’ - redukovaný (skutečný) retenční objem V m - mrtvý objem – mimokolonové příspěvky + mimočásticový objem kolony

14 Kapacitní faktor k’ V s – objem stacionární fáze V M – objem mobilní fáze c s – rovnovážná koncentrace látky ve stacionární fázi c M – rovnovážná koncentrace látky ve mobilní fázi Distribuční koeficient k’= 1 – 10

15 Selektivita Retenční faktor 

16 Účinnost kolony počet teoretických pater N YrYr ½Yr

17 Účinnost kolony výškový ekvivalent teoretického patra H l – délka kolony

18 Účinnost kolony

19 Rozlišení t r1 Y r1 Y r2 R 12 =1.5 – nulové překrytí R 12 =1.0 – překrytí 2 % Y r1 Y r2

20 Vliv jednotlivých faktorů na rozlišení

21 „Dynamická difuzní teorie“ Van Deemter

22 Van Deemterova difuzní teorie Difuse turbulentní Difuse molekulová Odpor proti převodu hmoty

23 Difuse turbulentní A

24 Difuse molekulová B

25 Odpor proti převodu hmoty C

26 Van Deemterova rovnice u H optimum

27 Síly a efekty využívané při separaci Iontové síly Polární síly Nepolární síly Sterické interakce Efekt velikosti molekul

28 Rozdělovací chromatografie

29 cScS cMcM Použití – analytická PC, TLC

30 Adsorpční chromatografie

31 cScS cMcM

32 Stacionární fáze – polární Silikagel SiO 2. n H 2 O Oxid hlinitý Al 2 O 3, AlO(OH), Al(OH) 3 Hydroxyapatit [Ca 5 (PO 4 ) 3 OH]

33 Adsorpční chromatografie Mobilní fáze – nepolární Eluce - zvyšováním polarity mobilní fáze Eluotropická řada: uhlovodíky<subst.uhlovodíky<ketony< aldehydy<alkoholy<voda

34 Reverzně fázová chromatografie Stacionární fáze – nepolární C 8, C 18 Mobilní fáze – polární – vodné roztoky pH  potlačit disociaci Eluce – snižováním polarity mobilní fáze ACN, MetOH,

35 Reverzně fázová chromatografie H2OH2O Použití : analytické – až 90 % analýz Kartáčový typ stacionární fáze

36 Iontově párová chromatografie analyt iontově párující činidlo + - SDS, HClO 4 - - tetrabutylamonium

37 Iontově párová chromatografie sorbent C 18 iontový pár Stacionární, mobilní faze, eluce – RPC pH  plná ionizace analytu

38 Hydrofobní chromatografie Stacionární fáze – - C 8, -fenyl Mobilní fáze – vodné roztoky 1.7 M (NH 4 ) 2 SO 4 Eluce – snižováním iontové síly Použití : purifikace bílkovin

39 Ionexová chromatografie

40 + elektrostatická interakce + + Vazba Eluce

41 Ionexy Katexy - - vazba kationtů silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO 3 - slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) COO - Anexy - + vazba aniontů silné - dietylaminoetyl(DEAE) slabé – trietylaminoetyl(TEAE)

42 Slabý ionex Vykazuje změny vazebné kapacity v závislosti na pH Má pufrační kapacitu pH % COO - COOH

43 Ionexová chromatografie cScS cMcM kapacita ionexu

44 Donanův efekt OH - H3O+H3O+ H3O+H3O+ zvyšování pH snižování pH

45 Ionexová chromatografie Nanášení vzorku – nízká iontová síla Eluce – gradientová Zvyšováním iontové síly Změnou pH Afinitní eluce Použití – purifikace, zakoncentrování, výměna pufru

46 Chromatofokusace děj na koloně pH = 9pH = 4 R R

47 Chromatofokusace chování vzorku - +

48 pH 9 4 pI Použití : analytické – stanovení pI preparativní – purifikace bílkovin

49 Afinitní chromatografie

50 Afinitní interakce

51 Interakce mezi DNA a endonukleasou

52 Afinitní páry

53 Afinitní chromatografie nanesení vzorku

54 Afinitní chromatografie vznik interakce

55 Afinitní chromatografie vymytí balastů

56 Afinitní chromatografie eluce

57 Předpoklady pro vznik komplexu Sterické – použití raménka (spacer) Optimální pH, iontová síla

58 Předpoklady pro vznik komplexu Vazebné Konformační

59 Provedení Nanesení vzorku – nízká iontová síla Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity Použítí : analytické (stanoveni K), purifikace

60 Gelová permeační chromatografie

61

62 Princip - stérická exkluse - omezená difuse Pořadí eluce : MrA>MrB>MrC

63 Gelová permeační chromatografie Totální exkluse Totální permeace Selektivní permeace

64 Gelová permeační chromatografie Nanášení vzorku – objem vzorku < 2% objemu kolony Eluce – izokratická Použití : stanovení Mr, odsolování, purifikace

65 PC a TLC

66 1944 – Martin, Snyge - PC aminokyselin (Nobelova cena) 1952 – TLC nahrazuje PC

67 Instrumentace PC a TLC

68 Chromatografický papír Nemodifikovaný Modifikovaný – ionexy, acylace f. Watman (Anglie) Schleicher-Schüll (Německo)

69 TLC Vlastní příprava - sypané, nalévané Komerčně dostupné - Silufol (Cz) Watman

70 PC a TLC - mody rozdělovací adsorpční ionexová hydrofobní – RP a HIC gelová permeační

71 Nanášení vzorku Pipety Kapiláry

72 Provedení Vzestupné Sestupné Kruhové Dvojrozměrné

73 Vzestupné

74 Sestupné

75 Kruhové

76 Vyvíjení

77 Dvojrozměrné

78 Provedení Analytické Preparativní

79 Analýza kvalitativní standardy vzorky

80 Analýza kvantitativní Planimetrie Denzitometrie Plocha skvrn

81 Denzitometrie

82

83 Preparace PC – vystřižení a eluce skvrny TLC – vyškrábání a eluce skvrny – odsání a eluce skvrny

84 Chromatografie

85 Cvet – separace chlorofylů na CaCO 3 1901 termín „Chromatografie“ 1906

86 Kapalinová chromatografie rozdělení Nízkotlaká (atmosferický tlak) – LPC Střednětlaká (4 Mpa) – FPLC Vysokotlaká (40 Mpa) – HPLC

87 Kapalinová chromatografie využití LPC – preparativní FPLC – semipreparativní a analytická HPLC – analytická

88 Kapalinová chromatografie doba trvání LPC – hodiny FPLC – desítky minut HPLC – minuty

89 Zařízení pro LPC

90 Instrumentace pro LPC Pumpa – peristaltická nebo gravitace Gradient – mísič gradientu Dávkování – přímo pumpou na kolonu Kolony – skleněné Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm Vyhodnocování – zapisovač Sběrač frakcí – programovatelný

91 Instrumentace pro FPLC a HPLC

92 Zařízení pro HPLC

93 Pumpy

94 Tlaková pumpa

95 Lineární dávkovače

96 Pumpa jednopístová

97 Pumpa dvoupístová

98

99

100 Tlumení pulsů

101

102 Gradient nízkotlaký

103 Gradient vysokotlaký

104 Dávkování – dávkovací ventil

105 Dávkovací ventil – „Load“

106 Dávkovací ventil – „Inject“

107 Kolona

108 Částice sorbentu

109 Detektory

110 Refraktometrický detektor

111

112

113 UV – VIS detektor detekční cela

114 UV – VIS detektor s fixní vlnovou délkou

115 UV – VIS detektor s proměnlivou vlnovou délkou

116 UV – VIS detektor s diodovým polem

117 Fluorescenční detektor

118 Elektrochemický detektor

119 Konduktometrický detektor

120 LC-MS

121 „Termospray“

122 „Electrospray“

123 Ionizace

124 Ion Trap

125 Kvadrupol

126 „Light scattering“ detektor

127 Derivatizace „pre-column“ - před vlastní analýzou „post-column“ – za kolonou po analýze

128 Šum a drift detektoru Mez detekce S/N > 2-3 Mez stanovitelnosti S/N > 10

129 Lineární rozsah detektoru

130 Vyhodnocení Zapisovače Integratory Integrační software + PC

131 Zjištění plochy píků u zapisovačů vážením

132 Zjištění plochy píků u zapisovačů planimetrem

133 Zjištění plochy píků u zapisovačů výpočtem plocha = základna x výška

134 Integrator

135 Provedení Analytické Preparativní

136 Analýza kvalitativní Srovnání retenčních časů (objemů) píků u vzorku a standardů „spiking“ – přidání standardu do vzoru  nárůst výšky píků Specifická detekce – UV-VIS, fluorescence, elektrochemická MS

137 Analýza kvantitativní  Plocha (výška) píku Metoda externího standardu Metoda vnitřního standardu Metoda standardního přídavku

138 LC analýza

139 Plynová chromatografie Mobilní fáze-plyn Stacionární fáze-pevná fáze, kapalina

140 Výhody Nižší viskozita mobilní fáze Rychlejší difuze

141 Schéma plynového chromatografu

142 Plynový chromatograf

143 Zdroj nosného plynu

144 Elektrické měření průtoku

145 Nosné plyny PlynVýhodyNevýhody N2N2 levný, bezpečná práce nízká tepelná vodivost H2H2 vysoká tepelná vodivost explosivní Heinertnídrahý Arinertnídrahý

146 Příprava vzorků pro GC Plyny, kapaliny-přímo Pevné látky-po derivatizaci

147 Objemy dávkovaných vzorků Plyny-0.5 – 5 ml Kapaliny-0.1 – 10  l

148 Způsoby dávkovaní vzorků Přes septum Ventilem Termální desorpcí

149 Stříkačkou „splitless“ „split“

150 Dávkovací stříkačka

151 Rychlost dávkování

152 Způsob dávkování

153 Automatické dávkovače

154 Ventilem

155 Ventil

156 Dávkování termální desorpcí

157 Termostatování

158 Kolony Náplňové – ¼“ OD – ocel, sklo délka Kapilární – 0.1 – 0.5 mm ID - křemen, ocel, sklo délka –10 - 100 metrů

159 Kolony

160

161 Náplňová kolona

162 Kapilární kolona

163

164 Eluce

165 Izotermální Gradientová – zvyšování teploty – 400 o C Eluce

166

167 Detektory DestruktivníxNedestruktivní UniversálníxSelektivní

168 Teplotně vodivostní detektor TCD Universální detektor Nedestruktivní detektor Lineární rozsah – 10 6 Princip – změna tepelné vodivosti eluentu

169 Teplotně vodivostní detektor TCD

170

171 Plamenově ionizační detektor FID Specifický Destruktivní Lineární rozsah – 10 7 Princip – ionty vznikající spalováním vzorku vyvolávají nárůst proudu

172 Plamenově ionizační detektor FID

173

174 Detektor elektronového záchytu ECD Specifický Nedestruktivní Linearní rozsah - 10 4 Princip – interakce  - částic se vzorkem vyvolává pokles proudu

175 Detektor elektronového záchytu ECD  - - 63 Ni

176 Detektor elektronového záchytu ECD

177 GC MS permeační interface

178 GC MS přímé spojení

179 GC analysa

180 Superkritická fluidní chromatografie Mobilní fáze -superkritická kapalina Stacionární fáze -pevná fáze, kapalina

181 Superkritická kapalina

182

183 Superkritická fluidní chromatografie

184

185

186 SFC analysa

187 Superkritická fluidní extrakce

188 Používané kapaliny - CO 2 - levný, - netoxický - nízká kritická teplota Požívané modifikátory - HCl – kyselé prostředí - NH 3 – bazické prostředí

189 FFF Field Flow Fractionation

190 Field Flow Fractionation princip

191 Field Flow Fractionation instrumentace

192 Používaná pole Sedimetační Termální Hydraulické Elektrické

193 Preparativní FFF