Základní hematologická vyšetření Ústav patologické fyziologie 1.LF UK

HEMATOLOGIE . Leukémie apod. Anémie apod. (nedostatek elementů) (onkologická – lymfo- a myeloproliferativní onemocnění) Chronická myeloidní leukémie HEMATOLOGIE Anémie apod. (nedostatek elementů) trombocytopenie . Poruchy srážlivosti Primární hemostáza Sekundární hemostáza Krvácivé stavy/ trombo- embolické stavy

Klinické příznaky hematologického onemocnění Anémie → známky hypoxie – únava, slabost, pocit nedostatku dechu → známky nízké hladiny hemoglobinu - bledost → kardiovaskulární symptomy – palpitace Polycytémie → hyperviskozita krve → riziko trombózy Krvácení, spontánní krvácení, neustávající krvácení Trombóza → embolie – symptomy závisí na lokalizaci – DeepVenousTrombosis - HŽT, plicní embolie Časté infekce

Co vyšetřujeme? Krev Kostní dřeň - aspirační punkce - trepanobiopsie Lymfatické uzliny - extirpace

Přehled metod FW Krevní obraz Koagulace Cytochemie Vyšetření metabolizmu Fe Vyšetření metabolizmu HGB Imunologie Průtoková cytometrie Cytogenetika a molekulární biologie

Sedimentace erytrocytů (FW) Rychlost sedimentace závisí na tvorbě agregátů erytrocytů – penízkovatění (suspenzní stabilitě)

Zpomalení - albumin, polycytémie Metoda Fahreus-Westergrenova (FW) Zrychlení - fibrinogen, imunoglobuliny, CRP a jiné proteiny akutní fáze, anémie Zpomalení - albumin, polycytémie Metoda Fahreus-Westergrenova (FW) Norma: 2-5 mm/h u mužů 3-8 mm/h u žen (↓ ery, ↑ fibrinogen) Nespecifické vyšetření – screening, sledování průběhu (dynamiky) nemoci

Krevní obraz (KO) Hemoglobin (HGB) Hematokrit (HCT) kvantitativní vyšetření Hemoglobin (HGB) Hematokrit (HCT) Počet erytrocytů (RBC) Objem RBC (MCV) Množství HGB v RBC (MCH) Koncentrace HGB v RBC (MCHC) Distribuční šíře RBC (RDW) Retikulocyty (ret) Počet trombocytů (PLT) Distribuční šíře PLT (PDW) Objem PLT (MPV) Počet leukocytů (WBC) Diferenciální rozpočet WBC - segmenty a tyče - eozinofily - bazofily - monocyty - lymfocyty kvalitativní vyšetření

Krevní obraz – kdy? suspektní hematologické, neoplastické, zánětlivé nebo infekční onemocnění screening kojenců (<1 yr.), těhotných, starších pacientů a pacientů s hematolog. abnormalitami rutinní evaluace pacienta, příjem do nemocnice

Automatické stanovení hematologickými analyzátory

Jak funguje analyzátor ? - impedanční – při průchodu částice mezi elektrodami vzroste impedance - počet impulzů = počet částic - amplituda = objem částice - optické – při průchodu částice přes fokusovaný světelný paprsek dojde k rozptylu světla

Klasický krevní nátěr - při patologickém nálezu na analyzátoru - zhodnocení morfologie buněk

← sférocyty schistocyty →

Krevní nátěr Morfologie krevních elementů Anizocytóza = rozdíly ve velikosti Poikilocytóza = rozdíly ve tvaru (schistocyty =fragmenty erytrocytů; ovalocytes; sférocyty)

Různé tvary erytrocytů Sférocyty Ztráta centrálního projasnění, barví se tmavěji, často mikrocytární. Hereditární sférocytóza a některé získané hemolytické anémie Terčíkovité buňky Hypochromní s centrálním "terčíkem“ hemoglobinu. Choroby jater, thalasémie, hemoglobin D, postsplenectomii Eliptocyty Oválné až doutníkovité. Hereditární elliptocytóza, některé anémie (zvláště nědostatek vitamínu B-12 and folátu). Schistocyty Fragmentované přilbovité nebo trojúhelníkovité. Microangiopatické anémie, umělé srdeční chlopně, urémie, maligní hypertenze. Stomatocyte Erytrocyty mají štěrbinovitou oblast centrálního projasnění. Choroby jater, akutní alkoholizmus, malignity, hereditární stomatocytóza, and artefakt Srpky Podlouhlé buňky se zašpičatělými konci. Hemoglobin S a některé typy hemoglobinu C a l.

Srpkovitá anémie Hemoglobin (Hb) S arises from a mutation substituting thymine for adenine in the sixth codon of the beta-chain gene GAG to GTG. This causes coding of valine instead of glutamine in position 6 of the hemoglobin beta chain. The resulting hemoglobin has the physical properties of forming polymers under deoxy conditions. It also exhibits changes in solubility and molecular stability. These properties are responsible for the profound clinical expressions of the sickling syndromes. Under deoxy conditions, Hb S undergoes marked decrease in solubility, increased viscosity, and polymer formation at concentrations exceeding 30 g/dL. It forms a gel-like substance containing hemoglobin crystals called tactoids. The gel-like form of hemoglobin is in equilibrium with its liquid soluble form. A number of factors influence this equilibrium, including the following: Oxygen tension Polymer formation occurs only in the deoxy state. If oxygen is present, the liquid state prevails. Concentration of Hb S The normal cellular hemoglobin concentration is 30 g/dL. Gelation of Hb S occurs at concentrations greater than 20.8 g/dL. The presence of other hemoglobins Hemoglobin A and hemoglobin F have an inhibitory effect on gelation. These and other hemoglobin interactions affect the severity of clinical syndromes. SS hemoglobin produces a more severe disease than SC, SD, SO Arab, and SA hemoglobin.

Hemoglobin Stanovení spektrofotometricky po hemolýze erytrocytů a přeměně na hemiglobinkyanid Normální hodnoty ženy: 120 – 160 g/l muži: 130 – 175 g/l Zvýšení: polycytémie, dehydratace Snížení: anémie, hyperhydratace

Hematokrit HCT udává procentuelní zastoupení erytrocytů v objemové jednotce krve (analyzátor vypočítá HCT z RBC a MCV) Normální hodnoty ženy: 0,35 – 0,46 35 - 46 % muži: 0,40 – 0,50 40 – 50 % Zvýšení: polycytémie, dehydratace Snížení: anémie, hyperhydratace

Počet erytrocytů udáván v množství x1012/l nebo x106/μl Normální hodnoty ženy: 3,8 – 5,2 x 1012/l muži: 4,2 – 5,8 x 1012/l Zvýšení: polycytémie, dehydratace Snížení: anémie, hyperhydratace

MCV – mean cell (corpuscular) volume Výpočet: - určen přímo analyzátorem ! Normální hodnota: 80 – 99 fl Rozlišení - normocyty - mikrocyty - makrocyty

MCH – mean cell (corpuscular) hemoglobin Výpočet: Normální hodnota: 27 – 33 pg Rozlišení - normochromní RBC (normo nebo makrocyty) - hypochromní RBC (většinou mikrocyty)

MCHC – mean cell (corpuscular) hemoglobin concentration Výpočet: Normální hodnota: 33 - 37 % Hodnocení obdobné jako u MCH

RDW – red cell distribution width Analyzátor vytvoří v paměti histogram, RDW je šířka distribuce (obdobně se stanovuje PDW) (RDW je mírou anizocytózy)

Počet retikulocytů Stanovení z krevního nátěru obarveného brilantkrezylovou modří (počet / 1000 RBC) (analyzátorem – absolutní hodnoty) Normální hodnota: 0,5 – 1,5 % Zvýšení: zvýšená tvorba RBC v kostní dřeni (krvácení, hemolýza) Snížení až vymizení: útlum erytropoézy, útlum dřeně

Počet retikulocytů Stanovení z krevního nátěru obarveného brilantkrezylovou modří (počet / 1000 RBC) (analyzátorem – absolutní hodnoty) Normální hodnota: 0,5 – 1,5 % Zvýšení: zvýšená tvorba RBC v kostní dřeni (krvácení, hemolýza) Snížení až vymizení: útlum erytropoézy, útlum dřeně

Počet trombocytů Udává se v množství x109/l nebo x103/μl Normální hodnoty: 150 – 450 x 109/l Zvýšení: trombocytóza Snížení: trombocytopenie Funkční porucha: trombocytopatie

Počet leukocytů Udává se v množství x109/l nebo x103/μl Normální hodnoty: 4 – 10 x 109/l Zvýšení: leukocytóza Snížení: leukopenie

Diferenciální rozpočet leukocytů Udává zastoupení jednotlivých druhů leukocytů v krvi Vyjadřuje se v relativním (%) nebo absolutním počtu Poruchy: neutrofilie x neutropenie eozinofilie x eozinopenie bazofilie x bazopenie lymfocytóza x lymfopenie

Anémie

35 letá těhotná žena byla vyšetřena pro progredující únavu a zadýchávání při minimální zátěži. Klinické vyšetření až na bledé spojivky v normě.

Patofyziologie anémie málo hemoglobinu bledost špatná dodávka kyslíku do tkání tkáňová hypoxie únava, dyspnoe, palpitace, hyperkinetická cirkulace

Příčiny hypoxie Výšková hypoxie – nedostatek O2 ve vdechovaném vzduchu = nízký pO2 Respirační selhání – hypoxická hypoxie Nedostatek hemoglobinu – transportní = anemická hypoxie Porucha cirkulace – cirkulační hypoxie Porucha oxidace v mitochondriích – histotoxická hypoxie

Bylo vysloveno podezření na anémii, provedeno vyšetření krevního obrazu HGB 71 g/l (120 – 160 g/l) HCT 23% (35 - 46 %) RBC 2,5 x 1012 (3,8 – 5,2 x 1012/l) MCV 74 fl (80 – 99 fl) MCH 22 pg (27 – 33 pg) RDW 17,1% (13 – 15 %) ret 0,2% (0,5 – 1,5 %) WBC 5,4 x 109 (4 – 10 x 109/l) PLT 450 x 109 (150 – 450 x 109/l) Který parametr krevního obrazu diagnostikuje anémii? Proč není anémie definována hodnotami RBC a HCT? Jak lze anémii na základě hodnot KO blíže charakterizovat? mikrocytární hypochromní s anizocytózou hypoproliferativní

Anémie Hb Hct Ery Zákl. kritérium: Hb< 120 g/L M: < 135 g/L F: < 120 g/L Hct M: < 40 % F: < 37 % Ery M: < 4,3 * 1012 /L F: < 3,9 * 1012 /L Zákl. kritérium: Hb< 120 g/L

kmenové buňky, růstové faktory erytropoetin KOSTNÍ DŘEŇ erytropoetin dělení buněk, syntéza DNA: vitamín B12, k. listová syntéza hemoglobinu: globin, porfyrin, Fe jiné faktory PRODUKCE hemolýza PERIFERNÍ KREV ERYTROCYTY -KO ZTRÁTY hemoglobin, počet B-Ery, hematokrit MCV, MCH, MCHC tvar etc. krvácení

Vyšetření metabolizmu železa S-Fe S-feritin S-transferin Saturace transferinu Celková vazebná kapacita transferinu (Solubilní transferinový receptor)

Vyšetření metabolizmu železa Tranzitní pool Fe je stanovován jako sérové železo (veškeré železo je vázáno na transferin) a jako TIBC (celková vazebná kapacita) Pool Fe v zásobárnách je stanovován jako sérový feritin

Ukazatele železa Tělo - buňka Krevní plazma TIBC Ferritin Transferin Sérové železo Ferritin zásobárna Transferin Ferritin v séru

Vyšetření metabolizmu železa TIBC se zvyšuje při zvýšení sérového transferinu Saturace transferinu je vypočtená jako S-Fe/ TIBC sTfR vzniká proteolýzou membránového TfR, je nepřímým ukazatelem exprese TfR v organismu => zvýšen u deficitu železa a intenzivní erytropoézy

Ukazatele metabolismu železa Sérové železo ( SI) F: 600-1400 mg/L, 11-25mmol/L; M: 750-1500 mg/L, 13-27mmol/L Sníženo při nedostatku Fe a chronických chorobách Zvýšeno při hemolytických anémiích a hemochromatóze Celková vazebná kapacita železa (TIBC) 2500 – 4500 mg/L , 45-82 mmol/L Zvýšena u nedostatku Fe Sníženo při chronických chorobách Sérový ferritin (30-300 ng/mL) Velmi blízce reflektuje celkové zásoby Fe v organismu snížení <12 ng/mL - nedostatek Fe zvýšení při přetížení Fe, poškození jater, tumorech (protein akutní fáze)

Ukazatele metabolismu železa Sérový transferinový receptor Zvyšuje se při zvýšení erytropoezy a v časné fázi nedostatku Fe Erytrocytárni ferritin Stav zásob v průběhu posledních 3 měsíců (Fe deficit/přetížení) není ovlivněn akutní nemocí nebo funkcí jater Volný erytrocytární porfirin zvýšený při poruchách syntézy hemu

Latentní chybí sérové Fe sérové Fe sat. transferinu sTfR anémie Manifestní Latentní chybí sérové Fe pro erytropoezu sérové Fe sat. transferinu sTfR Prelatentní chybí zásobní Fe sérový ferritin TIBC/transferin Fe (sideroblasty) v dřeni

Příčiny anémie Sérové Fe ↓↓↓ ↑↑↑ Transferin/TIBC ↓ Ferritin ↑ Anémie chronických chorob Anémie z nedostatku železa Myelodys- plastický syndrom Sérové Fe ↓↓↓ ↑↑↑ Transferin/TIBC ↓ Ferritin ↑ Kostní dřeň Fe++ v MФ Chybí Fe Okrouhlé sideroblasty –zásoby Fe ↑ Dg. vodítka Základní onemocnění Příznaky ↓ Fe ?krvácení? Dyshemato- poeza

prodloužená hemoglobinizace mikrocyty mitózy prodloužená hemoglobinizace nedostatek Fe Proč je sideropenická anémie mikrocytární? Proč je přítomna anizocytóza?

50 letá žena přichází pro zhoršení dechu v několika posledních týdnech 50 letá žena přichází pro zhoršení dechu v několika posledních týdnech. Také si stěžuje na mravenčení prstů na levé noze. Při fyzikálním vyšetření zjišťujeme žlutě zabarvené skléry, červený a vyhlazený jazyk.

Pro podezření na anémii byl vyšetřen krevní obraz: HGB 65 g/l (120 – 160 g/l) HCT 19,3% (35 - 46 %) RBC 1,7 x 1012 (3,8 – 5,2 x 1012/l) MCV 114 fl (80 – 99 fl) MCH 33 pg (27 – 33 pg) RDW 22 % (13 – 15 %) ret 0,4% (0,5 – 1,5 %) WBC 2,0 x 109 (4 – 10 x 109/l) PLT 140 x 109 (150 – 450 x 109/l) O jaký typ anémie se jedná?

Vyšetření sérové koncentrace: vitaminu B12 kyseliny listové Proč je anémie makrocytární?

makrocyty ↑ prodloužená doba mezi bb děleními nedostatek kyseliny listové a vitaminu B12

Proč má pacientka pancytopenii ? Proč má pacientka parestézie? HGB 65 g/l (120 – 160 g/l) HCT 19,3% (35 - 46 %) RBC 1,7 x 1012 (3,8 – 5,2 x 1012/l) MCV 114 fl (80 – 99 fl) MCH 33 pg (27 – 33 pg) RDW 22 % (13 – 15 %) ret 0,4% (0,5 – 1,5 %) WBC 2,0 x 109 (4 – 10 x 109/l) PLT 140 x 109 (150 – 450 x 109/l) Proč má pacientka pancytopenii ? Proč má pacientka parestézie?

makrocytární anémie hypersegmentovaný neutrofil hypochromní mikrocytární anémie makrocytární anémie hypersegmentovaný neutrofil

Hemolytické anémie

Vyšetření metabolizmu hemoglobinu S-bilirubin – koncentrace odráží degradaci hemu (zvýšen u hemolytických anémií) S-haptoglobin (váže hemoglobin) S-hemopexin (váže hem) (sníženy u intravaskulární hemolýzy – tj. i u hemolytických anémií) Elektroforéza hemoglobinu – zjištění abnormálních hemoglobinů (hemoglobin S)

Vyšetření antierytrocytových protilátek (→ dg Vyšetření antierytrocytových protilátek (→ dg. autoimunitních hemolytických anémií) Přímý antiglobulinový test (Coombsův) - průkaz protilátek na povrchu erytrocytů pomocí antiglobulinového séra

TESTY HEMOLÝZY Hledáme protilátky proti erytrocytům Imunitní mechanismy – přímý Coombsův (antiglobulinový) test Hledáme protilátky proti erytrocytům Protilátky třídy IgG (tzv. nekompletní protilátky) Nikoliv protilátky AB0 Tyto protilátky jsou zodpo- vědné za hemolýzu

Nepřímý antiglobulinový test - průkaz volných protilátek v séru (po inkubaci RBC se sérem se přidá antiglobulinové sérum)

Zvýšená hemolýza (destrukce erytrocytů) retikulocytóza, LDH zvýšeno, akumulace nekonjugovaného hemoglobinu Extraerytrocytární příčiny (normocytární –normochromní erytrocyty ) Imunologické abnormality (AIHA, PNH, poléková) Fyzikální a chemické poškození erytrocytů (trauma, infekce malárie, umělá chlopeň, popáleniny, hadí jedy) Erytrocytární příčiny Alterace membrány kongenitální (sférocytóza, elipso) získané (PNH – paroxyzmální noční hemoglobinurie) Metabolické enzymatické poruchy (nedostatek G6PD - není glutathion) Hemoglobinopatie (Srpkovitá anémie, talasémie) G6PD deficienc over 100 mutant forms identified. X-linked, drug senzitive variety most common (drugs which produce peroxide) AIHA - autoimmune hemolytic anemia

Testy hemolýzy Testy osmotické rezistence Erytrocyty přežívají pouze v izotonickém prostředí ale mají jistou toleranci ke změnám tonicity. Erytrocyty u některých hemolytických stavů mají sníže- nou toleranci ke změnám osmotického tlaku Speciální testy membránové vlastnosti (electroforéza proteinů) vlastnosti hemoglobinu genetické testování

Test acidorezistence erytrocytů – Hamův test Diagnostický (screeningový) test pro paroxyzmální noční hemoglobinurii (PNH) Acidifikace krve HCl = kyselé prostředí aktivuje komplement – zvýšená hemolýza u osob s PNH PNH – snížená syntézy glykosylfosfatidylinositolu, který ukotvuje membránové proteiny regulující aktivitu komplementu Průtoková cytometrie zaměřená na vyhledávání snížení CD55 a CD59 potvrzuje dg.

Test acidorezistence erytrocytů – Hamův test

Rozdělení anémií podle příčiny Hypoproliferativní snížená produkce- porucha kmenových buněk a diferenciace nedostatek erytropoetinu porucha syntézy DNA porucha syntézy hemoglobinu kompletní ztráta erytropoezy má za výsledek pokles počtu erytrocytů 10% za týden Hyperproliferativní zvýšená destrukce erytrocytů – hemolýza defekt erytrocytů extraerytrocytární příčiny zvýšené ztráty krve – krvácení maldistribuce (hyperslenismus, pooling ve slezině)

Počet retikulocytů Denní náhrada erytrocytů 0.5 – 1.5% celkového počtu Dozrávají během 1 dne v periferní krvi Kriterium aktivity kostní dřeně – rozlišení anémií dle příčiny Reticulocytóza odpověď na ztrátu krve (hemolytické anémie, vážné krvácení) odpověď na terapii anémie (např. defic. B12 nebo Fe) Reticulocytopenie defekt erytropoezy

Anémie ze ztrát krve Akutní ztráta krve Chronická ztráta krve Krátce po masivnější ztrátě krve je Hb normální kvůli vazokonstrikci a faktu, že ledviny ještě nezačaly nahrazovat ztracený objem retencí vody a solutů Poté normochromní – normocytární anémie Chronická ztráta krve Vede k nedostatku železa a anémii z nedostatku železa

Zvýšená hemolýza (destrukce erytrocytů) retikulocytóza, LDH zvýšeno, akumulace nekonjugovaného hemoglobinu Extraerytrocytární příčiny (normocytární –normochromní erytrocyty ) Imunologické abnormality (AIHA, PNH, poléková) Fyzikální a chemické poškození erytrocytů (trauma, infekce malárie, umělá chlopeň, popáleniny, hadí jedy) Erytrocytární příčiny Alterace membrány kongenitální (sférocytóza, elipso) získané (PNH – paroxyzmální noční hemoglobinurie) Metabolické enzymatické poruchy (nedostatek G6PD - není glutathion) Hemoglobinopatie (Srpkovitá anémie, talasémie) G6PD deficienc over 100 mutant forms identified. X-linked, drug senzitive variety most common (drugs which produce peroxide) AIHA - autoimmune hemolytic anemia

Nedostatečná erytropoeza Sideropenie – nedostatek železa mikrocytární- anizocytóza, ↓ retikulocyty Megaloblastová anémie – nedostatek vitamínu B12 nebo Folátu macrocytární-anizocytóza selhání kostní dřeně - aplastická anémie, myelodysplastický syndrom, leukémie normocytární, normochromní hypoplázie kostní dřeně Iron deficiency: Include = anemia of chronic blood loss; Hypochromic-microcytic anemia; Hypochromic anemia of pregnancy, infancy, and childhood) BLOOD LOSS leadind cause; DEFECT IN FE UTILIZATION – hemoglobinopaties, sideroblstic and myelodysplastic anemia HIGH RDW --- ringed sideroblasts in BM SIDEROBLASTIC ANEMIA associated with myelodysplastic sy. Vitamin B12: RISK OF GASTRIC CANCER --- GI X-ray advised REQUIRES INTRINSIC FACTOR from gastric mucosa to absorb in the intestine Folate PROLONGD COOKING DESTROYS FOLATE, Peaple who eat marginal diet = TEA-and –TOASTERS, CHRONIC ALCOHOLICS Defective DNA synthesis ---- RNA synthesis continue ---- increased cytoplasmatic volume and maturation ---- increased intramedullar cell death = inefective erythropoiesis Chronic disease: JZ6]Kidney, endocrine – thyroid, pituitary, or protein depletion

Laboratorní vyšetření Základní: Krevní obraz Doplňková: testy na metabolismus železa hladina Erytropoetinu Detekce protilátek proti vlastním krvinkám – Coombsův test Test osmotické rezistence erytrocytů Hamův test (rezistence na kys. prostředí) Mikroskopické zhodnocení krevního nátěru Sternální punkce- aspirace kostní dřeně

Imunologická vyšetření Vyšetření krevních skupin (Přímý antiglobulinový test - ABO) (Nepřímý antiglobulinový test Rh)

Vyšetření krevních skupin ABO systém - vyšetření RBC pomocí diagnostických sér anti-A a anti-B - vyšetření sérových aglutininů anti-A a anti-B pomocí typových erytrocytů Rh(D) systém - vyšetření pomocí anti-Rh(D) séra

bed-side test

Cytochemie Průkaz látek v buňkách pomocí chemických reakcí, hodnocení periferní krve i kostní dřeně Reakce na železo (Perlsova reakce) - průkaz železa v erytroblastech (sideroblasty), erytrocytech (siderocyty) a makrofázích (siderofágy) Vyšetření některých enzymů (ALP, NE) - dg. a dif. dg. hematologických malignit

Průtoková cytometrie (flow cytometry) technika umožňující kvantitativně i kvalitativně analyzovat částice – buňky – v suspenzi. Umožňuje cíleně separovat buňky na základě jejich fyzikálních a chemických vlastností FACS (Fluorescence-activated-cell-sorting) - třídění buněčné suspenze dle odlišného rozptylu světla a fluorescenční charakteristiky buňky

Užití v hematologii: imunofenotypizace myeloproliferací a lymfoproliferací pomocí fluorescenčně značených monoklonálních protilátek