 Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Ošetření mateřských rostlin  Typ explantátu SLOŽENÍ MÉDIÍ Koncentrace živin v médiu [mmol/l]   Živina Knop Hoagland a Snyder Murashige a Skoog Gamborg Shenk a Hildebrandt NO3- 10,94 15,00 39,40 24,72 NH4+ - 20,61 2,02 2,06 celkový N 60,01 26,74 27,32 PO43- 1,84 1,00 1,24 1,08 2,6 SO42- 1,01 2,00 1,50 2,03 1,62 Cl- 5,98 2,04 2,72 K+ 4,30 6,00 20,04 Na+ Mg2+ Ca2+ 4,23 5,00 2,99 1,02 1,35 Hydroponická média Média pro kultivaci in vitro

SLOŽENÍ MÉDIÍ pro kultivaci rostlin in vitro Makroprvky Mikroprvky Nezbytné c) Vitaminy d) Aminokyseliny e) Sacharidy f) Doplňky g) Pufry h) Růstové regulátory i) Zpevňující složky Prospěšné až nezbytné

Cyklus kyseliny citrónové SLOŽENÍ MÉDIÍ Makroprvky – N, P, K, Ca, Mg, S Důležitá jak koncentrace, tak vzájemná vyváženost. N – nejprve jako zdroj N používány NO3- ; přidání redukované formy NH4+ může být prospěšné NO3-  NH4+ energie Cyklus kyseliny citrónové 2- oxoglutarát Proč ne jen NH4+ ??? toxicita při vyšších koncentracích (kompenzovat přídavkem kyselin Krebsova cyklu) příjem vede k poklesu pH  potřeba pufrovat média glutamát glutamin glutamát (2) NH4+

  pH  pH Příjem NO3-  při  pH, ……………. příjem NH4+  při  pH SLOŽENÍ MÉDIÍ Příjem NO3-  při  pH, ……………. příjem NH4+  při  pH NO3- OH- NH4+ H+   pH  pH NO3- OH- NH4+ H+ V médiu NO3- + NH4+ (počáteční pH média 5,4 -5,8)   nejdříve příjem NH4+    pH následuje příjem NO3-    pH

b) Mikroprvky – Fe, Mn, Zn, B, Cu, Co, Mo SLOŽENÍ MÉDIÍ b) Mikroprvky – Fe, Mn, Zn, B, Cu, Co, Mo Jsou součástí metabolicky a fyziologicky důležitých proteinů Chelatony - EDTA c) Vitaminy B1, B6, kys. nikotinová, (inositol) Rostliny jsou schopny vitaminy syntetizovat, rostlinné explantáty často nejsou soběstačné d) Aminokyseliny Okamžitě dostupný zdroj N; rychlejší příjem; organické a anorganické zdroje N nejsou zaměnitelné !!! Hydrolyzát kaseinu – směs aminokyselin a peptidů Samostatně : glycin, pro některé kultury k. glutamová, glutamin, k. asparagová, asparagin, … ostatní výjimečně

?? Navození autotrofie v podmínkách in vitro – typ kultury SLOŽENÍ MÉDIÍ Sacharidy Zdroj C a energie Explantátové kultury nejsou většinou autotrofní  nutnost dodat zdroj C a energie z média ?? Navození autotrofie v podmínkách in vitro – typ kultury vynechání sacharidu z média zvýšení koncentrace CO2 ( konc. CO2 v okolí nádob, propustné uzávěry kultivačních nádob) zvýšení ozářenosti, spektrum použitého světla ?? Vliv sacharidů v médiu na schopnost kultury fotosyntetizovat Heterotrofní kultury – plně závislé na vnějším zdroji C Mixotrofní kultury – fotosyntetizující + zásobované z média ?? Mixotrofie X úspěšnost přenosu do ex vitro podmínek

?? Jaký sacharid a v jaké koncentraci SLOŽENÍ MÉDIÍ ?? Jaký sacharid a v jaké koncentraci Nejčastěji: sacharóza 1-3 % - floémem transportovatelný sacharid u všech rostlin Dále: glukóza, maltóza, fruktóza, galaktóza, manóza, laktóza, manitol, sorbitol, rafinóza.. Požadavky se mohou velmi lišit v závislosti na rostlinném druhu i typu kultury a jejím vývoji ! Výběr vhodného sacharidu často na základě empirického přístupu Využitelnost sacharidu závisí na schopnosti kultury : transportovat daný sacharid (z buňky do buňky x vodivými pletivy) rozkládat daný sacharid vně buněk (sacharóza  glukóza + fruktóza, rafinóza  ? fruktóza + melibióza nebo sacharóza + galaktóza) přijímat daný sacharid (pasivní transport X aktivní transport) utilizovat daný sacharid (např. manitol, sorbitol, RFO) Př: Listové disky Capsicum annum  tvorba výhonů - glukóza Př: kultury izolovaných kořenů pšenice (a dalších jednoděložných) – glukóza Př: některé orchideje - fruktóza Př: kalus fazolu, somatická embrya jedle - maltóza Př: Rosaceae – sorbitol, jasan, celer, oliva – manitol Př: embryogenese u citrusů - galaktóza Př: kalus okurky - rafinóza

? Osmotikum Přítomnost sacharidu v médiu snižuje osmotický potenciál SLOŽENÍ MÉDIÍ Osmotikum Přítomnost sacharidu v médiu snižuje osmotický potenciál média  osmotický stres (morfogenní signál) Př: Somatická embryogeneze jehličnanů – pozitivní vliv vysokých koncentrací sacharózy lze nahradit osmotickým stresem vyvolaným manitolem Přítomnost sacharidu v buňkách  osmotické přizpůsobení (zachování transpotru vody při osmotickém stresu)  osmoprotekce (ochrana membrán a makromolekul při nedostatku vody) Osmoprotektant Signální molekula přímé působení sacharidu signál generován transportérem ? - rozhoduje míra transportu přes membránu sacharózové transportéry ( X jiné systémy vázané na membráně) hexózové transportéry hexokinázový systém – rozhoduje „rychlost“ fosforylace ? apoplastická invertáza invertáza x SuSy obsah sacharidů se promítá do hladiny sacharidu se signálním potenciálem (trehalóza-6-P) nebo jiné signální molekuly (SnRK1) Cukr může indukovat změny hladin fytohormonů (auxinů a cytokininů)

f) Doplňky g) pH média- Pufry h) Růstové regulátory SLOŽENÍ MÉDIÍ f) Doplňky Dodávají báze NK, NK, aminokyseliny, vitaminy, růstové regulátory … Extrakty : bramborový, kvasničný extrakt Tekuté endospermy: rajčatová šťáva, banánová šťáva, nejčastěji… kokosové mléko g) pH média- Pufry Stabilizace pH médií užitím organických pufrů pH ovlivňuje rozpustnost solí pH ovlivňuje příjem látek z média (živin i hormonů) pH ovlivňuje gelační schopnosti agaru (pod pH 5 nedostatečná gelace) h) Růstové regulátory Funkce nikoli nutriční, ale regulační Účinné ve velmi nízkých koncentracích. Ovlivňují současně velký počet rozdílných procesů. Nejdůležitější in vitro : auxiny, cytokininy, kys. abscisová, gibereliny

Auxin cytokininový model - tabák, Skoog a Miller, 1957 SLOŽENÍ MÉDIÍ Auxin cytokininový model - tabák, Skoog a Miller, 1957 auxin Tvorba kořenů na řízcích Embryogeneze Tvorba adventivních kořenů v kalusu Iniciace kalusu Tvorba adventivních výhonů Proliferace úžlabních výhonů cytokinin Rozhoduje: endogenní hladina růstových regulátorů, která je výsledkem interakce endogenních hladin fytohormonů a exogenní aplikace růstových regulátorů. volba vhodného fytohormonu a nebo růstového regulátoru s obdobným účinkem

?  Habituace ? mechanismus habituace ? SLOŽENÍ MÉDIÍ auxin Habituace Iniciace kalusu =tkáňová kultura po opakovaných pasážích ztrácí závislost na exogenním cytokininu Habituace je mitoticky přenosná vlastnost cytokinin ? mechanismus habituace ? syntézy cytokininů ? Pravděpodobně NE exprese cytokininového receptoru CRE 1 exprese genů účastnících se cytokininové signalizace exprese receptorů AHK3, AHK2 Analýza transkriptomu u Arabidopsis up-regulace transkripčních faktorů, transposonům příbuzných elementů, DNA- a chromatin modifikujících enzymů… změna asi 800 genů  reverzibilní  epigenetická komplexní změna

ABA zlepšení kvality somatických embryí zabránění předčasnému klíčení somatických embryí navození klidového stádia při přípravě umělých semen regulace syntézy zásobních látek v embryích zvýšení desikační tolerance synchronizace somatické embryogeneze zvyšuje stresovou toleranci zpomaluje růst udržovacích kultur snižuje transpiraci během aklimatizace rostlin ex vitro zvyšuje frekvenci přežívajících explantátů po kryoprezervaci Rai et al., 2011

Interakce: minerální výživa X růstové regulátory SLOŽENÍ MÉDIÍ Interakce: minerální výživa X růstové regulátory ??? optimální obsah minerálních složek média; ??? mohou minerální živiny částečně nahradit roli R.R. ??? mohou R.R. kompenzovat disbalanci v minerální výživě Rozhoduje hlavně N a jeho forma : Poměr HN4+: NO3- má vliv na : dediferenciaci růst morfogenezi Důležitý také poměr N:cukr  N   IAA  N   ABA   GA  N   cytokinin  N   etylén Př: Kořenění segmentů Cizrna WH +IBA 70 % zakořeněných segmentů WH + 20 % -,,- ½ WH +IBA 47 % zakořeněných segmentů ½ WH + 46 % -,,-

i) Zpevňující složka Př: Kořenění segmentů: Leucopogon (extrém) SLOŽENÍ MÉDIÍ Př: Kořenění segmentů: Leucopogon (extrém)  soli +  R.R 70 % zakořeněných segmentů MS + NAA 38 % -,,- Př: Produkce adventivních výhonů: Jalovec MS + BA + NAA 9 % segmentů tvořících výhony HS + BA 18 % -,,- Př: Produkce somatických embryí : Jasan MS + BA + NAA 17 % explantátů tvořících SE DKW +  20 % -,,- i) Zpevňující složka Nejčastěji : agar (agaróza) Tvoří gel, taje při 100 °C a tuhne při  45 °C; není tráven rostlinnými enzymy, nereaguje se složkami médií ( ?? inertní ) XX Tekutá média – prámky, můstky, zavěšené kapky, „temporary immersion systems“.

ASEPTICKÁ KULTIVACE Sterilizace výchozího materiálu  Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Typ explantátu  Ošetření mateřských rostlin ASEPTICKÁ KULTIVACE Sterilizace výchozího materiálu Sterilizace médií, nástrojů Detekce kontaminace Citlivost kontaminujících organismů Použití antibiotik Omytí ředěným roztokem detergentu Omytí tekoucí vodou Ošetření sterilizačním činidlem : NaClO, Ca(ClO)2 AgNO3, H2O2, HgCl2, EtOH kontakt činidlo-sterilizovaný materiál (EtOH, smáčedlo, snížený tlak, míchání) trvání sterilizace – krátké  nedostatečná sterilizace dlouhé  poškození rostlinných pletiv koncentrace sterilizačního roztoku, vysoká X nízká Závěrečné omytí sterilní vodou

 Sterilizace je úspěšná při co nejnižší výchozí hladině kontaminace ASEPTICKÁ KULTIVACE Sterilizace je úspěšná při co nejnižší výchozí hladině kontaminace  důležitý je výběr explantátu části rostlin ve styku s půdou - silně kontaminovány rostliny rostoucí za nízké rel. vlhkosti a nezalévané na list – málo kontaminovány kontaminace se mění výrazně v závislosti na ročním období úspěch jen když vnitřní pletiva jsou prosta kontaminace Sterilizace médií, nástrojů ( pokles pH o 0,3-0,5 ) autoklávování – 120 °C; 0,1 MPa, doba sterilizace závisí na objemu média. filtrace – skleněné frity, membránové filtry suché teplo – 3h 150 °C  - radiace, páry kys. peroctové

ASEPTICKÁ KULTIVACE Detekce kontaminace viditelný růst latentní kontaminace  zpomalený růst, špatné zakořeňování, náhlý úhyn rostlin po mnoha subkultivacích  kontaminace napadá pletiva, snižuje pH, vyčerpává živiny, produkuje fytotoxické látky detekce – přeočkování na různé půdy - někdy lze detekovat jen sérologicky nebo e- mikroskopií Citlivost kontaminujících organismů většina kontaminací nepřečká běžné sterilizační postupy ale !! Někdy velká odolnost: rod Bacillus : 5 min ponoření do EtOH, opálení lihovým kahanem, ale i 1 týden v EtOH, i 20 min při 110 °C, výjimečně 20 min při 120 °C. Použití antibiotik nemají nahradit pečlivost aseptické práce ! některá antibiotika podporují růst častěji – fytotoxicita - antibiotika, která interferují se syntézou DNA, RNA působí i na eukaryota; výhodné pokud specificky působí na mikroorganismy nejlépe znát citlivost kontaminujícího mikroorganismu antibiotika působí na aktivně rostoucí organismy rezistence

TYP EXPLANTÁTU Genotyp: Dvouděložné Jednoděložné Nahosemenné  Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Typ explantátu  Ošetření mateřských rostlin TYP EXPLANTÁTU Genotyp: Dvouděložné Jednoděložné Nahosemenné Nejlépe reagují: Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Brassicaceae Stáří: a) stáří jedince „skutečné stáří“--- počet dní od vyklíčení rostliny „fyziologické stáří“----fáze růstu a vývoje rostliny c) u již založené kultury in vitro rozhoduje subkultivační interval b) relativní stáří pletiva (hodnocení velmi obtížné např.: Vzrostný vrchol z 50 let staré rostliny v juvenilním stavu je „ mladý“. U dřevin nejlepší výsledky s výhony u báze kmene) Většinou nejvhodnější explantát z nově založených orgánů Méně často - z plně vyvinutých orgánů V některých případech jen změna postupu morfogeneze: explantát z mladých listů nejprve koření z dospělých listů nejprve tvoří pupeny

Velikost explantátu Polarita explantátu třeba zvolit optimální -- příliš malý explantát  velké hynutí, ---- malé zásoby živin, hormonů,  poměr poraněná : neporaněná část povrchu,  produkce etylénu -- příliš velký explantát  špatná manipulace, horší styk s médiem, malý množitelský efekt Polarita explantátu !! vhodné umístění vzhledem k médiu, zachovaná polarita včetně směru transportu látek

OŠETŘENÍ MATEŘSKÝCH ROSTLIN  Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Typ explantátu  Ošetření mateřských rostlin OŠETŘENÍ MATEŘSKÝCH ROSTLIN Stav rostlin: zdravé, aktivně rostoucí, bez stresu, dostatek živin Termín odběru: změny v teplotě, fotoperiodě, osvětlení  hladiny cukrů, proteinů, R.R Dormance: většinou aktivně rostoucí, ne vždy ! Př: tvorba náhradních pupenů na kořen. řízcích dřevin --- jen z dormantních rostlin Působení teploty: teplota při kultivaci mateřské rostliny ovlivňuje chování explantátu Př: % vytvořených pupenů slivoně je úměrné době udržování mat.r. při 4°C Působení světla: promítá se do hladin zásobních látek, R.R.  změny v chování explantátu Působení R.R: ovlivňuje jak růst, tak morfogenezi Př: rajče, ošetření chlormequatem (inhibice syntézy giberelinů)  zvýšení tvorby pupenů na listových explantátech