Variabilita a změny genetické informace, mutace RNDr Z Variabilita a změny genetické informace, mutace RNDr Z.Polívková Přednáška č.69 - GIE

Mutace x polymorfismy Mnoho genů – pouze jedna normální verze = „wild type“ alela Jiné geny vykazují polymorfismus (mnoho forem-normálních) v populaci Polymorfismus – variantní alely relativně časté Mutantní alely – vzácné – detegovány skrze klinicky významné genetické choroby Existuje-li více mutatních alel v jednom lokusu = alelická heterogenita

Mutace = náhlá, neusměrněná, trvalá změna genetického materiálu Mutace: spontánní indukované Mutace: somatické – nádory, stárnutí buňky gametické- genetická choroba nebo nosičství mutace v další generaci Mutace: tiché=tolerované=neutrální ztrátové výhodné

genomové – změna v počtu chromozomů: Mutace: genomové – změna v počtu chromozomů: a) euploidní změna = násobek haploidní sady (př.triploidie) b) aneuploidie = chromosom navíc nebo chybí (př. trizomie, monozomie) chromozomové = strukturní chrom.aberace = zlomy a výměny genové = kvalitativní nebo kvantitativní změna sekvence bazí

GENOVÉ MUTACE Rozdělení podle důsledků: SYNONYMNÍ.........nevedou k záměně AK MISSENSE .............chybný smysl - záměna AK NONSENSE............vznik terminačního kodonu ELONGAČNÍ.........mutace terminačního kodonu POSUNOVÉ............inzerce, delece (počet bazí není násobkem 3) Mutace genů pro rRNA a tRNA - chyby translace

Rozdělení podle mechanismu vzniku: SUBSTITUCE → záměna AK - nefunkční enzym - změněná specificita (kys.dusitá,alkylační látky ) metabolické vady - A a INZERCE - posunové mutace, posun čtecího rámce DELECE (akridinová barviva –inzerční mutace)

Příklady mutací: A) SUBSTITUCE (alkylace, metylace, hydroxylace→chybné párování) záměna 1 baze (bodová mutace) = záměna 1AK MISSENSE MUTACE - chybný smysl a) uvnitř kódujících sekvencí Př.: srpkovitá anemie G A G → G T G v beta globinovém genu glu → val → HbS

A → G v oblasti promotoru genu pro faktor IX. b) vně kódujících sekvencí Př.: hemofilie B: A → G v oblasti promotoru genu pro faktor IX. → změněné množství produktu NONSENSE MUTACE - vznik terminačního kodonu → vznik abnormálního produktu Př.: neurofibromatosa NF1 C G A → T G A arg stop v nádor. supresorovém genu

MUTACE RNA SPLICINGU mezi exonem a intronem Př.: Tay-Sachsova choroba mutace v hexosamidasovém genu - není vyříznut intron mezi exonem 12. a 13. defekt hexosamidázy A

B) DELECE, INZERCE (1 nebo více párů bazí, delece části genu, celého genu i více genů - mikrodeleční sy) a) malého počtu bazí (ne násobek 3) posun čtecího rámce ( frame shift mutace ) Př.: ABO krevní skupiny delece G T G → posun čtení v genu pro alelu A → O Tay - Sachsova choroba inzerce 4 párů bazí → posun čtení a vznik stop kodonu b) 3 nebo násobek 3 bazí Př.: cystická fibrosa nejčastěji delece 3 bazí → chybí 1 AK ( např. delta F 508 = chybí fenylalanin)

c) celého genu Př.: X- vázaná ichtyosa delece genu pro steroidní sulfatázu d) velké části genu Př.: Duchennova muskulární dystrofie delece dystrofinového genu (asi 60 % případů ) Vznik velkých delecí a inzercí : nerovnoměrným crossing overem (aberantní rekombinace) Př.: delece alfa globinového genu u alfa thalasemie delece pigmentových genů u barvosleposti delece retinoblastomového genu

Mutageny Fyzikální: záření UV – dimery T-T, C-C, T-C = poruchy replikace, traskripce ionizační (rtg,gama) přímý účinek záření – zlomy DNA nepřímý účinek – ionizace molekul prostředí- zlomy DNA Chemické látky – alkylační látky - addukty - analogy bazí - akridinová barviva – inzerce - kys. dusitá – deaminace bazí – porucha párování látky přímo působící nepřímo působící – po metabolické aktivaci (cytochrom dependentní oxygenázy) Biologické – viry – integrace do genomu hostitelské buňky

tento typ mutací nevzniká v důsledku působení mutagenů ! Mutace dynamické – postupný vznik – počáteční změna potencuje další změnu = amplifikace opakování tripletů, např. fragilní X vznik přes „premutaci“ v předchozí generaci tento typ mutací nevzniká v důsledku působení mutagenů !

Nádory Dědičnost: většinou děděna vnímavost - multifaktoriálně 5% familiární nádory (AD s neúplnou penetrancí) u všech se uplatňují mutace při vzniku Nádor = genetické onemocnění = důsledek mutací a dalších genetických změn nádor = klon - vznik z 1 buňky formy - sarkom - z mezenchymální tkáně karcinom - z epiteliální tkáně leukemie - hematopoetická tkáň lymfomy - lymfoidní tkáň

Klonální vznik nádoru Genetická změna v 1 buňce, její namnožení

Nádory – benigní - maligní Charakteristika maligních nádorů: invazivní růst metastazování Vznik nádoru = vícestupňový proces faktory genetické + faktory vnějšího prostředí

Karcinogenní faktory prostředí: chemické - karcinogeny Genetické faktory: Mutace: protoonkogenů - (AD ) → onkogeny = abnormál. buněč.dělení nádorových supresorových genů - (AR) = ztráta funkce obou alel = abnormál.buněč. dělení mutatorových genů (reparačních) - (AR) - zvýšená frekvence mutací - maligní transformace Karcinogenní faktory prostředí: chemické - karcinogeny fyzikální - UV, ionizující záření biologické - DNA nádorové viry RNA nádorové viry - retroviry

Onkogeny Protoonkogeny - kontrola buněčného dělení, diferenciace produkty: růstové faktory, receptory růstových faktorů GTP vazebné proteiny tyrozinkinázy (fosforylace proteinů) cytoplazmatické proteiny proteiny kontrolující buněčný cyklus …. úloha v buněčných komunikacích a v přenosu signálu

Změna protoonkogenu na onkogen : - bodovou mutací - chromozomální translokací → fuzované geny nebo asociace s jinými regulačními sekvencemi - inzercí retroviru - amplifikací: „ double minutes“ – volné kopie onkogenu HSR = homogenně se barvící oblasti = amplifikované kopie, integrované do chromozomu dysregulací imprintingu (metylace) – epigenetické změny stačí změna v jednom párovém protoonkogenu – mutace má dominantní charakter

Chromozomální translokace Důsledek změny: tvorba abnormální produktu nebo nadprodukce normálního produktu Chromozomální translokace př. CML = chronická myeloidní leukemie Ph1 chromozom - t (9;22) c abl z 9q přenesen na 22q → chimerický gen (fuzovaný bcr/abl) → abnormální protein se zvýšenou tyrozinázovou aktivitou - abnormální stimulace buněč.dělení př. BL= Burkittův lymfom - t(8;14) c myc z 8q přenesen na 14q do blízkosti imunoglobulinových genů - vysoká transkripční aktivita → nadprodukce normálního produktu

Cme.medscape.com

Detekce fuzovaných genů lokus specifickými sondami Wysis katalog 1996/97

Fuzovaný gen bcr/abl u CML

Translokace 8q/14q u Burkittova lymfomu ncbi.nlm.nih.gov

Cytogenetická manifestace amplifikací: „double minutes“ - volné kopie HSR=homogenně se barvící oblasti =tandemně integrované kopie nebo kopie vmezeřené do různých míst chromozomu

Detekce amplifikace onkogenů lokus specifickou sondou

Úloha virů při vzniku nádorů schopnost virů integrovat svoji NK do genomu hostitelské buňky - nesou onkogeny (buď vlastní - DNA nádorové viry) nebo přenáší buněčné protoonkogeny- RNA nádorové viry) Buněčné protoonkogeny homologní virovým onkogenům Retroviry = RNA nádorové viry v-onkogeny - nemají introny původ z protoonkogenů hostitelské buňky genom viru replikován a transkribován hostitelskou buňkou transcript - mRNA protoonkogenu po vyříznutí intronů se stane součástí virového genomu spolu s virovou RNA

př.virus Rousova sarkomu virus v hostitelské buňce: RNA viry - přepis reverzní transkriptázou integrace onkogenu do DNA hostitelské buňky = akutní nádorové viry (př.RSV, gen src = onkogen, delece src - virus je infekční, množí se, ale netransformuje buňku) integrace proviru - latentní nádorové viry = nemají onkogen, ale integrují se do sousedství buněčného protoonkogenu - svými „enhancery“ (=regulační sekvence) aktivují vyšší transkribci protoonkogenu (př.ALV - ptačí leukozové viry)

Nádorové supresorové geny produkty: blokují růst a buněčné dělení mutace tumor supresorových genů - recesivní charakter – mutace obou alel - ztráta funkce (Loss Of Heterozygozity - LOH)

Př. Retinoblastom (model 2 stupňového vzniku nádoru) dědičný nádor: časný nástup, bilaterální 1.stupeň: mutace zárodečná (zděděná nebo vzniklá „de novo“- tj. v 1 pohlavní buňce), nebo delece na 13q (gen pro Rb protein) zárodečná mutace je ve všech buňkách jedince (heterozygot) 2. stupeň: mutace somatická v 1 buňce retiny = ztráta heterozygozity (LOH=loss of heterozygosity)

Retinoblastom = mutace nádorového supresorového genu (AR), ale dědičnost AD s neúplnou penetrancí!!! - je vysoká pravděpodobnost druhé mutace sporadický nádor: unilaterální většinou, pozdější nástup, obě mutace somatické v 1 buňce retiny -nastávají v průběhu života Další př. Wilmsův tumor (embryonální tumor ledvin) nádorový supresorový gen na 11p

Nádorový supresorový gen TP53 (protein p53) (17p13) - reguluje aktivitu genů, jejichž produkty reagují s DNA poškození dočasnou zástavou buněč. cyklu - umožnění reparace (blokáda G1-S = velký repair, S-G2 = postreplikační repair) pokud poškození není zreparováno - vyvolání apoptozy = programovaná buněčná smrt mutace p53 - výskyt v různých nádorech (Li Fraumeni syndrom - nádorové rodiny=rodiny s vysokým výskytem různých nádorů v časném věku )

Rodina se syndromem Li- Fraumeni

Mutátorové geny geny DNA reparace - odpovídají za reparaci poškození DNA mutace mají recesivní charakter Př.: dědičný nádor tlustého střeva, bez předchozího polypózního stadia (tzv. dědičný nepolypózní kolorektální nádor tl.střeva nebo rekta)

Mnohastupňový vznik nádoru- více genetických změn 1.stupeň může být dědičná změna – mutace na 5q APC (adenomatózní polyposis coli)– střevní polypóza, Gardnerův sy tu su genu APC 5q Mutace/delece Ztráta iheterozygozity DNA hypometylace Mutace K-ras onkogenu 12p Normální epitel. buňka Nadměrná proliferace Adenom I raný tu su genu DCC 18q Mutace/delece, chrom. ztráta chrom.ztráta tu su genu p53 na 17p Ztráta heterozygotnosti Mutace/delece Karcinom Adenom II Středně pokročilé Adenom III metastáze DCC- deleted in colorectal cancer

Vlastnosti normální a maligní buňky in vivo maligní zvrat - nekontrolovatelné množení - invazivní růst - metastazování (lymfogenně, hematogenně) in vitro normální maligní kontaktní inhibice nakupení omezený počet generací nesmrtelnost původní antigenní determinanty nádorové, fetální antigenní determinanty euploidie různé aberace tvar specifický dediferenciace

Další faktory karcinogeneze: 1. Geny podmiňující přeměnu chemických látek = metabolická aktivace – polymorfismus genů geneticky podmíněná schopnost detoxikovat škodlivé látky enzym arylhydrokarbon hydroxyláza - přeměna polycyklických hydrokarbonů (cigaretový kouř) na epoxidy (karcinogenní) Jedinci s vysoce aktivní alelou a kuřáci nebo osoby pracující v riziku (asbest) = riziko Ca plic recesivní homozygoti - enzym neaktivní - nemetabolizují = rezistentní na CA plic Různé variantní alely = různá aktivita enzymu

2. Geny DNA reparace – polymorfismus = různá aktivita 2. Geny DNA reparace – polymorfismus = různá aktivita reparačních enzymů 3. Geny imunitní odpovědi Imunitní systém: T lymfocyty - cytotoxický efekt + cytokiny NK buňky - nespecificky cytotoxické selhání imunitních mechanismů - rozvoj nádoru defekt v imunitě - vrozený nebo získaný =zvýšené riziko nádorů př. AIDS = vysoké riziko nádorů

Genotoxické účinky: mutagenní karcinogenní teratogenní – poškození plodu v těhotenství imunosupresivní alergenní

Teratogeneza Morfogenetické procesy proliferace distribuce a migrace integrace redukce

Morfogenetické systémy: embryonální - orgán.soustavy, orgány fetální - orgánové složky perinatální - integrované systémy (nervový, endokrinní, imunitní) postnatální - krvetvorba, imunitní systém Regulační mechanismy v morfogenezi: vnitrobuněčné - regulace transkripce mezibuněčné - kontakty buněč. membrám mediátory působící na krátkou vzdálenost - cAMP hormony - působí na delší vzdálenost

Vrozené vývojové vady - extinkce 16% oplozených vajíček se nerýhuje 15% se neimplantuje 27% ztráty během prvních týdnů těhotenství 1-2% novorozenců - vvv

VVV- příčiny: 20% vvv příčiny genetické (monogenní nebo chrom. abnormalita) 10% - polygenní (genetické + prostředí) 10% viry 5% léky, chemické látky zevní příčiny, ale interakce s genotypem 5% metabolická dysbalance matky 1% radiace 50% vůbec neznáme příčinu - předpoklad interakce genetických a exogenních faktorů

Teratogeneza embryotoxický efekt smrt malformace růstová retardace porucha funkce Citlivost k teratogenům: genotyp matky + embrya druh teratogenu a dávka prostupnost placentou období, kdy teratogen působí

Kritická perioda: období, kdy se daný morfogenet.systém vyvíjí v terminačním bodě-kritická velikost období, do kdy je možno vyvolat vvv Sensitivní perioda teratogenu: závisí na typu teratogenu a dávce posunuje se s dávkou Průnik kritické a sensitivní periody - vznik vvv

- obecně cytotoxické - působí na proliferaci Teratogeny: - obecně cytotoxické - působí na proliferaci záleží na tom, co se právě vyvíjí - specifické – receptorové Vzrůst znečištění život. prostředí: frekvence vad se nezvyšuje, ale mění se spektrum vad - ubývá těžkých vad - potratí se

funkční maturace implantace histogeneze oplození embryogeneze organogeneze porod 0 5- 6 25 60 29 týden dny období embryonální fetální perinatální postnatální vše/nic vznik velkých vad funkční vady (karcinogeneze) menší vady

Teratogeny: Fyzikální: radiace (vyšetření radioizotopy) hypertermie (horečka >39oC>2 dny, lázeň) Chemické: léky, drogy 1. prokázané: vit. A a jeho analogy cytostatika warfarin 2. pravděpodobné: antiepileptika lithium (psychofarmakum) 3. možné: hormonální preparáty inhibitory enzymů (ACE) diazepam salicyláty drogy: alkohol, kokain, LSD, cigarety

Biologické: 1. viry: zarděnky, neštovice, chřipka, CMV 2. bakterie: Treponema pallidum – syfilis 3. parazité: Toxoplasma gondii (akutní infekce) Plasmodium Mateřské faktory: 1.výživa: jod, vápník, vitamin D, kys. listová, bílkovinná podvýživa 2.choroby: diabetes mellitus, fenylketonurie, hypo(hyper)thyreosa, hypoxie