Katedra laboratorních metod LF MU Mgr. Jana Gottwaldová Optické metody Katedra laboratorních metod LF MU Mgr. Jana Gottwaldová

Optické analytické metody Fyzikální metody, které získávají potřebné informace z měření optických vlastností a spekter zkoumaných látek. využívá interakce analytu se světlem - optických vlastností molekul a atomů měřené soustavy může jít o změnu barvy či její intenzity, luminiscenci, fluorescenci, změnu optické otáčivosti nebo o změnu rozptylu světla při průchodu vzorkem

Spektrofotometrie x fotometrie Patří mezi nejpoužívanější optické metody v biochemii Stanovení vlastností vzorku, např. koncentrace určité látky, na základe pohlcování světla určité vlnové délky se označuje jako fotometrie. Pokud se neměří jen při jedné vlnové délce, ale hodnotí se určitý úsek spektra, mluvíme o spektrofotometrii.

Spektrofotometrie-rozdělení Podle frekvence elektromagnetického záření: UV spektr. – zahrnuje oblast záření λ=190-400 nm VIS spektr. – oblast viditelného záření λ=400-800 nm IČ spektr. – oblast IČ spekter se dělí na blízkou IČ λ=800-2000 nm, dalekou IČ λ=105 nm

Spektrofotometrie-rozdělení Podle typu interakce elektromagnetického záření: absorpční spektrofotometrii emisní spektrofotometrii Turbidimetrii, nefelometrii Luminiscenční metody: fluorimetrie,fosforescence, chemiluminiscence

Optické metody jsou založeny na výměně energie mezi látkou a zářením Světlo je druhem elektromagnetického záření Vlastnosti elektromagnetického záření - má duální charakter Složku magnetickou a elektrickou Vzdálenost mezi dvěma vrcholy vln se nazývá vlnová délka- λ, udává se v nm

Elektromagnetické záření

Popisující veličiny elektromagnetického záření rychlost – c (m/s), ve vakuu 3x108 m/s vlnová délka -  (nm) Frekvence světelných vln (=počet vln za sekundu) - (Hz,s-1)

Popisující veličiny elektromagnetického záření energie fotonu světelného záření ε Energie fotonu je přímo úměrná jeho kmitočtu, h je Planckova konstanta (6,625x10-34 J/s) Energie fotonu je nepřímo úměrná vlnové délce tzn. že světelné záření o kratší vlnové délce má vyšší energii, než světlo s delší vlnovou délkou

Elektromagnetické záření Světlo v UV a VIS oblasti má kmitočet (počet vln za s) 1014 -1015 Hz Monochromatické - světlo, které se skládá pouze z jedné vlnové délky Polychromatické – skládá se z mnoha vlnových délek (sluneční světlo, světlo wolframové žárovky)

Barevnost látek Pokud absorbované záření má λ ležící v oblasti viditelné části spektra, látka se jeví lidskému oku jako barevná Má vždy barvu doplňkovou k barvě absorbovaného světla

Barevnost látek

Barevnost látek

Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii Propustnost (transmitance): Množství světla určité vlnové délky, které prošlo vzorkem Kde I0 je intenzita světla vstupujícího do vzorku a I je intenzita světla ze vzorku vystupujícího

Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii Absorbance: Bezrozměrná veličina, definovaná na základě transmitance, udává jaké množství světla bylo pohlceno vzorkem.

Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii Zákon Lambertův-Beerův: I = I0 . 10-ε l c Intenzita světelného záření procházející absorbujícím prostředím klesá exponenciálně v závislosti na délce absorbující vrstvy a koncentraci absorbující látky (Johan Heinrich Lambert, 1728-1777)

Zákon Lambertův-Beerův absorbance při dané vlnové délce přímo úměrná tloušťce absorbující vrstvy l koncentraci absorbujících částic ve vrstvě c Konstanta úměrnosti pro danou látku a danou vlnovou délku absorbovaného záření je molární absorpční koeficient ελ

Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii molární absorpční koeficient ελ: fyzikální konstanta, která udává jak daná látka při určité koncentraci absorbuje monochromatické záření určité vlnové délky Takto lze zjistit koncentraci látek barevných, nebo látek absorbujících světlo v UV oblasti Pokud látka v těchto oblastech neabsorbuje, je třeba ji převést na látku, která absorbuje více Vztah mezi signálem ( absorpcí) a koncentrací se určuje kalibrací

Kalibrační závislost Praktické využití Lambertova-Beerova zákona Provedení: změříme obvykle 5 standardních roztoků o známé vrůstající koncentraci při určité vlnové délce všechny roztoky se měří za stejných experimentálních podmínek (spektrometr,kyveta,pipety,doba inkubace..) blank = slepý pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky

Kalibrační závislost Ast Sestrojení kalibrační křivky naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y hodnoty koncentrace na ose x Pokud je závislost lineární, je možné změřit absorbanci a vypočítat koncentraci neznámého vzorku : Avz Cvz= x cst Ast

Kalibrační závislost Vzhledem k tomu, že poměr cst/Ast je pro měřenou sérii konstantní používáme ho pro změřenou sérii jako kalibrační faktor, kterým vynásobíme naměřené hodnoty absorbance vzorků o neznáme koncentraci LOD-dolní mez detekce LOL- horní mez detekce LOQ-mez stanovitelnosti

Limitace Lambertova-Beerova zákona Odchylka ελpři vysokých koncentracích (>0,01 mol/l) vlivem elektrostatických interakcí Částečný rozptyl světla na částicích přítomných ve vzorku Fluorescence nebo fosforescence vzorku Nedokonale monochromatické záření Nekoherentní světelné záření Nejpřesnější výsledky jsou získávány v rozsahu absorbancí 0,2-0,7 . Od hodnot absorbance > výrazně narůstá chyba měření

Spektrofotometrie-rozdělení Podle typu interakce elektromagnetického záření: absorpční spektrofotometrii emisní spektrofotometrii Turbidimetrii, nefelometrii Luminiscenční metody: fluorimetrie,fosforescence, chemiluminiscence

Absorpční spektrofotometrie zabývá kvantitativním hodnocením změny intenzity záření (obvykle určité vlnové délky) po průchodu analytickým prostředím. Při průchodu ektromagnetického záření z oblasti UV nebo VIS části spektra měřeným roztokem dochází k absorpci záření. Přístroje, které se používají k měření intenzity záření v ultrafialové (UV) nebo viditelné (VIS) oblasti spektra se nazývají fotometry nebo spektrofotometry.

Emisní spektrofotometrie Při této technice se měří emise záření. K emisi záření charakteristické vlnové délky dochází při návratu elektronů z excitovaného stavu (vyvolaného plamenem) do základního stavu. Přístroje, které se používají k měření intenzity emisního záření, se nazývají emisní spektrofotometry

Absorpce vs. emise záření Emise záření: Dodáním energie (např. kinetické, tepelné) jsou částice látka (složky studovaného vzorku) převedeny do vyššího energetického stavu Při zpětném přechodu se energie vyzáří ve formě fotonu Absorpce záření: Částice látky absorbuje foton a přejde přitom do vyššího energetického stavu. (Návrat zpět do energeticky nižšího stavu již není sledován.)

Turbidimetrie Optická metoda založená na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích V klinické biochemii je celá řada metod založených na měření stupně zákalu - turbidity - a nejvýznamnější z nich je soubor imunochemických metod, které využívají precipitační reakce mezi antigenem a protilátkou záření po průchodu nehomogenním prostředím, tj. koloidním roztokem nebo roztokem zakaleným jemnou sraženinou se měří absorpčními fotometry a spektrofotometry

Nefelometrie zabývá se měřením intenzity difúzně rozptýleného světla na dispergovaných částicích Rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření. Pro tyto účely slouží buď nefelometrický nástavec k fotometru, u nichž se difúzně rozptýlené světlo sleduje pod úhlem 90°, nebo jsou vyvinuty speciální přístroje - nefelometry

Luminisceční metody: fluorimetrie Při fluorimetrických stanoveních se využívá jevu, kdy v některých látkách po ozáření dostatečně energetickým zdrojem světla (excitační záření) vzniká fotoluminiscence. Přístroje, které se používají k měření intenzity emisního záření se nazývají fluorimetry

Luminisceční metody -chemiluminiscence Liší se od ostatních luminiscenčních jevů tím, že excitace fotonů je vyvolána chemickou reakcí. Přitom se však uvolněná energie nesmí uvolnit jako teplo. Některé látky dokáží část energie vyzářit ve formě fotonu přímo, což se projeví krátkým světelným zábleskem, v ostatních případech je nutné přidat do soustavy další látku, na kterou se energie přenese a která pak (zpravidla řadu sekund až minut) emituje světlo. Muže jít o syntetické luminofory nebo o přírodní enzym luciferázu světlušek – pak se mluví o bioluminiscenci. Luminimetrické metody bývají poměrně citlivé. Luminimetry jsou principiálně podobné emisní spektrofotometrii

Spektrofotometry Přístroje, které se používají k měření intenzity záření v ultrafialové (UV) nebo viditelné (VIS) oblasti spektra Slouží pro měření absorpce světla vzorkem Absorbance je měřena při různých vlnových délkách

Uspořádání spektrofotometru Zdroj světla Optický systém: štěrbiny, zrcadla, čočky Monochromátor nebo filtr: k výběru určité vlnové délky Absorpční prostředí: kyveta s měřeným vzorkem Detekční systém: zařízení k měření světelného záření, které prošlo vzorkem

Zdroje záření a jejich použití Wolframová žárovka – měření absorpce ve viditelném spektru Deuteriová (vodíková) výbojka - měření absorpce v UV spektru Xenononová výbojka- měření absorpce v oblasti VIS UV spektru Rtuťová výbojka – měření v oblasti spektra 200-400 nm

Wolframová žárovka – VIS oblast spektra Skleněná baňka naplněná inertním plynem obsahující páry jódu Uvnitř je wolframové vlákno, které je zahříváno stejnosměrným proudem

Deuteriová výbojka – UV oblast spektra Nízkotlaké, produkují světlo o vlnové délce 160-360 nm

Xenonová výbojka – blízká UV oblast nebo IČ oblast spektra Vysokotlaká (pevnější plášť), výboj vzniká mezi dvěma wolframovými vlákny, potřebuje intenzivní chlazení

Rtuťová výbojka – blízká UV a VIS oblast Nízkotlaká, poskytuje přesně definované čárové spektrum (200-400 nm) Pro klinickou biochemii je významná spektrální čára o vlnové 334 nm – pro měření redukované formy NADP (absorpční maximum 340 nm)

Spektrofotometr - fotometrické filtry Slouží k vymezení určitého ( co nejužšího) pásu monochromatického světla ze spojitého záření. Charakteristikou filtru je tzv. spektrální pološířka filtru (h, nm) - odpovídá intervalu vlnových délek záření v polovině maximální propustnosti filtru (je odvozena z křivky propustnosti). Čím je rozsah pološířky filtru užší, tím je filtr lepší. Fotometrické filtry dělíme na dvě základní skupiny: barevné absorpční a interferenční

Spektrofotometr - fotometrické filtry Křivka propustnosti Spektrální pološířka filtru (h, nm) - odpovídá intervalu vlnových délek záření v polovině maximální propustnosti filtru – transmitance,je odvozena z křivky propustnosti). Čím je rozsah pološířky filtru užší, tím je filtr lepší. transmitance

Fotometrické filtry Barevné absorpční filtry - mají nižší spektrální čistotu filtrovaného záření, jejich pološířka je 30-80 nm Pevné - skla vyrobená z oxidy kovů, nebo pokrytá vrstvou želatiny s organickým barvivem Kapalné – obvykle kyvety s roztoky anorganických solí

Fotometrické filtry-interferenční filtry Interferenční filtry využívají mnohonásobnou interferenci záření mezi hraničními plochami s výbornými odrazovými vlastnostmi, mají užší šířku pásma a vyšší pík transmitance (lepší propustnost) než barevné absorpční filtry. Nejvíce rozšířený je kovový Fabry-Perotův filtr. a, c – polopropustné vrstvičky b – vrstva dielektrika o tloušťce /2 d, e – krycí vrstvy

Fotometrické filtry-interferenční filtry Na základní desce je mezi dvěma stříbrnými polopropustnými vrstvičkami vrstva průhledného dielektrika o tloušťce /2, přičemž  odpovídá požadované vlnové délce. Mnohonásobnými odrazy od zrcadlových ploch filtru a po vícenásobné interferenci dopadajících paprsků různé vlnové délky, vznikají velmi úzká maxima s pološířkou 8 – 10 nm.

Spektrofotometr - monochromátory Optická zařízení pomocí kterých se ze spektra polychromatického světla mechanicky vymezí pouze jeho určitá část. Slouží pro kontinuální výběr různých vlnových délek

Monochromátor Monochromátor se skládá: vstupní štěrbiny pomocné optiky (zrcadla, čočky) disperzního prvku - mřížka,hranol výstupní štěrbiny

Monochromátor- vstupní a výstupní štěrbina Vstupní – vymezuje malou část světelného toku ze zdroje záření Výstupní štěrbina – slouží k výběru záření určité vlnové délky, čím je užší tím užší je šířka pásma (bandpass) a větší monochromatičnost záření. Poloha štěrbin je neměnitelná, požadovaná vlnová délka se nastavuje přímým otáčením disperzního prvku.

Monochromátor - pomocná optika Zrcadla - jsou to plochy odrážející záření, jsou potažena obvykle vrstvou hliníku Rovinná – nejvíce používaná Dutá, kulová , parabolická Čočky – optický zaostřovací systém Optická vlákna – skleněná, křemenná usměrňují transport světla ve stísněných prostorách (vertikální fotometry k měření mikrotitračních destiček), mají větší světelné ztráty než zrcadla Clony – používají se k omezení průřezu svazku paprsků, k odstínění okrajové oblasti čoček a zrcadel

Disperzní prvek - optický hranol rozkládá polychromatické světlo na principu lomu světla světelné paprsky o kratší vlnové délce (modré světlo) se lámou více než paprsky s delší vlnovou délkou Skleněný hranol - pro rozklad světla ve VIS oblasti spektra (400-800 nm) Křemenný hranol – pro UV oblast (do 200 nm)

Disperzní prvek – difrakční reflexní mřížka pracuje na principu odrazu světla Je tvořena soustavou jemných rovnoběžných vrypů na skleněné destičce (nejkvalitnější až 1700 /1 mm) Na vybroušených ploškách dochází mřížky dochází k složitým optickým procesům-odraz, interference světla, které vedou k tomu, že z mřížky vychází jednotlivé vlnové délky pod rozdílným úhlem, který závisí na vlnové délce záření Rozklad záření je lineární u všech vlnových délek Má lepší rozlišovací schopnost než hranol

Výběr požadované vlnové délky ☼ Přesným pohybem disperzního prvku monochromátoru je vzniklé světelné spektrum nasměrováno na výstupní štěrbinu tak, aby jím prošlo záření požadované vlnové délky

difrakční reflexní mřížka optické zrcadlo zdroj světla difrakční reflexní mřížka mikrometrický šroub kyveta detektor

Spektrofotometr - Absorpční prostředí Kyveta s měřeným vzorkem Rozdělení: dle velikosti: Makro- (1-2 ml), semimikro- (<0,5 ml), mikro-(<100 μl) dle typu: nalévací, průtokové dle materiálu: skleněné, plastové (akrylátové, polystyrenové), křemenné (UV oblast) automatických bioch. analyzátorech: kyvety na jedno použití trvalé – po změření se promyjí mycí stanicí

Absorpční prostředí spektrofotometru zatavené kyvety z plastické fólie postup miniaturizace kyvet 400 µl 150 µl 80 µl

Spektrofotometr - detekční systém Je složen z detektoru záření a elektronického zařízení pro zpracování jeho odezvy Detektory Zařízení, které zprostředkovávají přeměnu energie záření na jinou formu – obvykle fotochemickou, elektrickou Hradlový selenový fotočlánek Fotodioda Fotonásobič Detektor diodového pole

Detektor – hradlový selenový fotočlánek Skládá se z polopropustné vrstvy stříbra nanesené na vrstvě selenu (polovodič) na kovovém podkladě Světelné záření o vlnové délce λ dopadající na polovodič působí uvolnění elektronů, které přecházejí do vrstvičky stříbra Tím vzniká elektrický proud, který je proporcionální intenzitě světelného záření

Detektor – fotodioda (fotonka) Pracuje na principu fotoelektrického efektu Skládá se z fotosenzitivní katody (obsahuje Ag a různé alkalické kovy a jejich oxidy) a anody umístěné ve vakuu Fotokatoda uvolňuje při ozáření světlem elektrony, které jsou přitahovány anodou čímž vzniká el. proud, který je proporcionální intenzitě světelného záření

Detektor - fotonásobič Elektrony z fotokatody jsou postupně přitahovány k sérii dynod, na které je vloženo postupně se zvyšující napětí Když elektron narazí na dynodu uvolní z ní mnohem více elektronů, které jsou přitahovány k další dynodě Obsahuje až 10 dynod, z nichž každá následující má až o 50 V vyšší napětí Toto vnitřní zesílení signálu umožňuje převést i velmi slabé světelné záření na měřitelné hodnoty elektrického proudu

Detektor - fotonásobič

Detektor s diodovým polem Je tvořen velkých množstvím miniaturních fotodiod na malé ploše destičky na které dopadá světelné záření po průchodu absorpčním prostředím a následně rozložené monochromátorem na jednotlivé vlnové délky

Detektor s diodovým polem Rozdíl oproti klasickému spektrofotometru – monochromátor je umístěn až za kyvetou se vzorkem Použití : v HPLC (UV/VIS detektor), automatické biochemické analyzátory Usnadňuje tzv. bichromatické měření absorbance

Bichromatické měření absorbance měření vzorku při dvou vlnových délkách součastně použití vlnové délky (λ2) mimo absorpční maximum (λ1) Používá se za situace, kdy se v reakční směsi vyskytuje látka, která rovněž absorbuje záření použité vlnové délky (interferující látka) Omezí se falešně zvýšený výsledek měření

Konstrukce spektrofotomeru Jednopaprskové Umožňují měřit absorbanci pouze v jednom absorpčním prostředí (tj. v kyvetě s měřeným vzorkem nebo v kyvetě s blankem) Zdroj světla Vstupní štěrbina Monochromátor Výstupní štěrbina Kyveta detektor

Konstrukce spektrofotomeru Dvoupaprskový Dvě základní konstrukční řešení: Paprsek určité vlnové délky z monochromátoru je rozdělen na dvě části, jedna polovina prochází kyvetou se vzorkem, druhá s kyvetou s blankem – vyžaduje 2 detektory Paprsek vycházející z monochromátoru je rotujícím zrcadlem střídavě usměrňován na kyvetu se vzorkem a směrován na jeden společný fotonásobič

Blank ☼ M < Vzorek ☼ M Blank Vzorek

Kontrola kvality spektrofotometru Přesnost nastavené vlnové délky Ověřuje, že vlnová délka nastavená na přístroji odpovídá skutečné vlnové délce procházejí měřeným vzorkem. Použití rtuťové výbojky (ostré čárové spektrum) Použití absorpčních filtrů (z kysličníku holmia) s přesně definovaným absorpčním pruhem – filtr je přístrojem naskenován a zjištěný absorpční pík je srovnán se známým píkem. Povolená tolerance je ± 1-2 nm.

Kontrola kvality spektrofotometru Přesnost spektrofotometru - schopnost změřit absorbanci přesně. K ověření se používají speciální absorpční filtry nebo roztoky o známé koncentraci Absorbance se proměřují v celém rozsahu spektra 302, 395, 512, 378 nm)

Kontrola kvality spektrofotometru Linearita spektrofotometru – schopnost vykazovat lineární odezvu měření postupně ředěného roztoku o známé koncentraci Výsledkem je přímkový graf závislosti A (osa y) na c (osa x) Měření se provádí při λ - 257, 41, a 630 nm

Kontrola kvality spektrofotometru Rozptýlené světlo Světlo, které může dopadnout na detektor aniž by prošlo měřeným vzorkem (př. nedokonalé odstínění optického systému spektrofotometru) Ověřuje se vložením neprůsvitného bloku do nosiče kyvety a sledováním odezvy detektoru Drift signálu Schopnost detektoru udržovat konstantní hodnotu Sledování nulové linie

Děkuji za pozornost