Mutageneze/karcinogeneze seminář

Klíčová slova k opakování Genotoxicita, mutace spontánní a indukované, mutace somatické a gametické, mutace genové, chromozomové a genomové, substituce, delece, inzerce, posunová mutace (frame shift), missense mutace, nonsense mutace, elongační mutace, synonymní mutace, mutagen, karcinogen, teratogen, ultimativní karcinogen, promutagen, prokarcinogen, nepřímý mutagen, addukt, iniciačně promoční teorie, zpětná (reverzní) mutace, Amesův test, auxotrofie, mikronukleus test, cytogenetická analýza, kometový test, sesterské chromatidové výměny, dynamické mutace Buněčný protoonkogen, virový onkogen, akutní a latentní nádorové viry Dědičnost nádorového onemocnění, mnohastupňový vznik nádoru, onkogeny, nádorové supresorové geny, mutátorové geny, změna protoonkogenu na onkogen, fúzovaný gen bcr/abl, translokace protoonkogenu s následnou overexpresí, ztráta heterozygozity („Loss of heterozygosity“), retinoblastom, gen TP53, Li-Fraumeni syndrom, geny DNA reparace

teratogenní – poškození vývoje plodu imunosupresivní alergenní Genotoxické účinky: mutagenní karcinogenní teratogenní – poškození vývoje plodu imunosupresivní alergenní Každý mutgen= susp.karcinogen !!! neplatí naopak – negenotoxické karcinogeny !!!

Mutageny Fyzikální: záření UV – dimery T-T, C-C, T-C ionizační (rtg, gama) přímý účinek záření – zlomy DNA nepřímý účinek – ionizace molekul prostředí zlomy DNA Chemické látky alkylační látky – addukty analogy bází – poruchy párování bází akridinová barviva – inzerce kys. dusitá – deaminace bází – porucha párování Látky přímo působící nepřímo působící – po metabolické aktivaci (cytochromy) Biologické – viry – integrace do genomu

Metabolismus genotoxických látek – individuální variabilita Fáze I : derivatizační: oxidace, redukce, hydrolýza - ↑hydrofility enzymy: monooxygenázy CYP450 = komplex enzymů, inducibilních, polymorfních Fáze II : konjugační – vznik konjugátů např s glutathionem enzymy: glutathion-S-transferáza (GST) glukuronyltransferáza sulfo-, acetyltransferázy … = enzymy inducibilní, polymorfní Cíl: přeměna lipofilních látek na polární sloučeniny, a jejich vyloučení z organizmu V procesu detoxikace - možné zvýšení mutagenity metabolitů (u tzv.nepřímých mutagenů - oxidační reakce→zvýšení reaktivity produktu)

Aktivita enzymů ovlivněna tzv Aktivita enzymů ovlivněna tzv. polymorfismy genů– malými změnami v primární struktuře DNA, které nemají patologické důsledky, vedou jen k odlišné aktivitě enzymu a jsou v populaci časté Týká se nejen genů kodujících enzymy metabolismu, ale také např. genů DNA reparace aj.

Iniciačně promoční teorie vzniku nádorů Prokarcinogen Metabolic.aktivace enzymy I.fáze Ultimativní karcinogen Detoxikace enzymy II.fáze Iniciace 1-2 dny Promoce 10 let Progrese  1 rok v Normální buňka Iniciovaná buňka Preneoplastické buňky Nádor Mutace, ztráta heterozygosity Podpora proliferace - negenotoxické karcinogeny + ev.mutace Genomová nestabilita, akumulace dalších genetických a epigenetických změn

Metody testování genotoxických účinků Testy in vitro: Amesův test – bakteriální Testy in vivo: Mikronukleus test Cytogenetická analýza Cytogenetická analýza = sledování získaných chromozomálních aberací (zlomů a přestaveb) v kostní dřeni exper. zvířete, v lidských periferních lymfocytech Sesterské chromatidové výměny – BUdR metoda – výměny mezi sesterskými chromatidami Comet test – sledování zlomů DNA

Princip Amesova testu Kmeny Salmonella typhimurium (TA98,TA100) nesou mutaci v genu pro syntézu histidinu Nejsou schopny tvořit histidin z dostupných živin; jsou auxotrofní - nerostou v mediu bez histidinu Pouze bakterie, které prodělaly reverzní (zpětnou) mutaci vytvoří kolonie

Některé látky vyžadují tzv Některé látky vyžadují tzv.metabolickou aktivaci = nepřímé mutageny (jsou mutagenní až po přeměně enzymatickým systémem) – přidání S9 frakce jaterního homogenátu (příprava z jater potkanů vystavených směsi mutagenů) – obsahuje enzymy, které metabolizují testovanou látku

Odečítání Amesova testu – obrazová analýza (Lucia)

Mikronukleus test Cytogenetická metoda testování mutagenního účinku různých látek - mikronukleus = chromozomální fragment, který zůstal mimo jádro, nebo celý chromozom Princip: stanovení frekvence mikrojader a) v erytrocytech kostní dřeně – u lab. zvířat b) v periferních lymfocytech – i u lidí (po zablokování cytokineze cytochalasinem) Výhoda: in vivo podmínky při testování na laboratorních zvířatech

Mikronukleus v erytrocytech exp. zvířete http://faculty.ksu.edu.sa/al-saleh/Pages/LabAlbum.aspx

Mikronukleus test Mutagenně působící látky vyvolávají změny v chromozomální výbavě buněk (zlomy) chromozomální fragment nebo celý chromozom, který se nezačlenil do dceřinného jádra tvoří mikrojádro Zvýšený počet mikrojader/1000 buněk ve srovnání s kontrolou je známkou mutagenního působení testované látky

„Comet assay“ – kometový test Metoda testující mutagenní účinky látek analýzou zlomů DNA Metoda založená na principu elektroforézy Odečítáme množství zlomů DNA Výhoda: sleduje aktuální stav poškození DNA ještě před reparací

Provedení „comet assay“ Aplikace testované látky laborator. zvířeti Usmrcení zvířete, odběr vzorků tkání (kostní dřeň, krev, játra aj.) Izolace buněk (trypsinizace) Lyze buněk buněk Rozpletení DNA v alkalickém roztoku Elektroforéza DNA v gelu na sklíčku Obarvení (ethidiumbromid); odečtení fragmentů DNA – „ohon komety“

Comet assay – odečítání (analýza obrazu)

Cytogenetická metoda = sledování chromozomálnmích aberací CHROMOZOMOVÉ MUTACE=CHROM.ABERACE Získané – výskyt v malém podílu somatických buněk (cca ve 2%) Vznik působením mutagenů Typ aberace závisí na: typu (klastogenního) agens fázi b. cyklu, ve které působí př. ionizující záření: ozáření lid.lymfocytů in vitro (G0 fáze) - po kultivaci - aberace chromozomového typu (dicentry a ringy, zlomy obou chromatid) po ozáření v G2 fázi – chromatidové aberace chemické látky – aberace chromatidové, vznik při replikaci (chromatidové zlomy, chromatidové výměny)

Vznik chromozomální aberace: Primární léze DNA ► zlomy vláken, alkylace aj. alterace bazí ▼ Reparace event.chybná reparace, nezreparované poškození chromozomální aberace

Cytogenetická metoda - sledování frekvence chromozomálních aberací v kostní dřeni exp. zvířete

Vyšetření lidských periferních lymfocytů Vystavení lidských periferních lymfocytů dárce in vitro testované látce v průběhu kultivace zpracování buněk cytogenetickou metodou (kolchicin, hypotonie, fixace), příprava preparátů, barvení hodnocení počtu aberantních buněk, typů aberací Nebo u osob vystavených mutagenům (in vivo) – kultivace periferních lymfocytů – zpracování cytogenetickou metodou , barvení Hodnoceno 100-200 buněk

Typy aberací Chromatidová výměna Dicentrický chromozom s difragmentem Chromatidové zlomy

Typické aberace po ozáření: dicentrické a prsténcové chromozomy Frekvence dicentrů zjištěná po ozáření neznámou dávkou - využití k biologické dozimetrii radiační expozice ale dicentry = nestabilní aberace !!! Frekvence translokací stabilní po mnoho let – retrospektivní dozimetrie (metoda FISH) Stabilní aberace (ale i dicentry) se kumulují s věkem, event.snížení reparačních schopností – nutno brát v úvahu u populačních studií

Cytogenetická metoda = biomarker expozice genotoxickým látkám = biomarker účinků na člověka (predikce rizika nádorů) Použití jako skupinový expoziční test i k posouzení expozice jednotlivce

Hodnocení: Hodnocení získaných chromozomálních aberací (ZCHA): skupina  20 osob – hodnoceno à 100b. jednotlivci, skupina  20 osob – hodnoceno à 200b. Hodnotí se % aberantních buněk, % aberací, typy aberací 0-2% - normální hladina 2-4% = zvýšení 4% = vysoká hladina Hodnocení: Rössner: Metody biologického monitorování genotoxických účinků faktorů pracovního prostředí. Cytogenetická analýza periferních lymfocytů. Čs prac.lék., Suppl.1, 2000

Metoda hodnocení sesterských chromatidových výměn (SCE) BUdR metoda – kultivace buněk v přítomnosti BUdR po dobu 2 cyklů dělení SCE= zlomy DNA a reciproké výměny DNA duplexů mezi sesterskými chromatidami, vznik v S fázi

+ BrdU po 2 cykly dělení –BrdU = analog tyminu První mitoza: Obě chromatidy stejně substituovány BrdU- tmavé 1. Druhá mitoza: jedna chromatida tmavá, druhá (s oběma vlákny substituovanými BrdU) světlá - zpoždění spiralizace = světlé zbarvení 2. b) sledování sesterských chromatidových výměn = metoda testování mutagenních účinků

Buňka neovlivněná mutagenem – malý počet výměn

Buňka ovlivněná mutagenem (zvýšený počet SCE)

Metody testování mutagenních účinků slouží k predikci karcinogenních účinků (jsou mnohem rychlejší než testy karcinogenity) Každý mutagen = potenciální karcinogen, ale jsou i negenotoxické karcinogeny

Mutace dynamické postupný vznik – počáteční změna potencuje další změnu = amplifikace opakování tripletů, např. fragilní X, Huntingtonova choroba vznik přes „premutaci“ v předchozí generaci tento typ mutací nevzniká v důsledku působení mutagenů !

Jaké znáte typy mutací? Jaké jsou důsledky somatických a gametických mutací? Uveďte příklady fyzikálních, chemických a biologických mutagenů. Vysvětlete pojem genotoxicita. Jaké jsou typické chromozomální aberace po ozáření, po působení chemických látek? Jaké jsou genetické příčiny vzniku nádorů? Jaké jsou mechanismy přeměny protoonkogenu na onkogen? Uveďte příklady translokací vedoucích ke vzniku nádorového onemocnění, vysvětlete mechanismus. Vysvětlete vznik dědičného a sporadického retinoblastomu. Co jsou mutatorové geny? Jak může metabolismus ovlivnit mutagenitu chemické látky? Vysvětlete úlohu virů při vzniku nádorů. Co jsou dynamické mutace? Jaké znáte metody testování mutagenních účinků?