Protein Targeting Nobel Lecture, December 8, 1999 by Günter Blobel

Co bylo známo

David D. Sabatini vazba ne přes mRNA, ale přes její produkt - Rb nerozlišitelné - rozebrat na definované komponenty a rekonstituovat in vitro První hypotéza

- translace poly(A) mRNA lehkého řetězce IgG buněk myelomu in vitro bez mikrosomů poskytla větší produkt (o 2-3kDa) První náznaky Bernhard Dobberstein

- proteáza je asociovaná s membránou (odmyta s membránami) - lokalizována na trans-straně membrány (na cis stranu se váže signální sekvence) - kotranslační a kotranslokační štěpení - proteiny bez signálního peptidu vznikají dříve Možné řešení

- post-translační přídavek mikrosomů do translační reakce poskytl menší IgG (3) - globin by neměl mít signální sekvenci, ale sedimentoval s mikrosomy „Potvrzení“ signální sekvence - proteolytické enzymy je degradují, ne však „dospělý“ IgG - degradují také „nezralý“ (větší ) IgG - - lokalizace uvnitř x vně mikrosomů

Další rozpracování signální hypotézy 1975: - v membráně ER kanál - vazba velké podjednotky Rb - i proteiny transmembránové - a obdobné sekvence pro transport do ostatních kompartmentů - potvrzeno až

Membránové proteiny glycoprotein vesicular stomatitis virus (G protein VSV) - jeden transmembránový úsek Vishvanath (Vishu) Lingappa

G protein VSV - vyizolovat G protein z VSV infikovaných buněk - s mikrosómy je ale větší! - glykosylace (na membránách aktivované oligosacharidy a oligosacharidyl transferázy) - biochemicky potvrzena amino-terminální sekvence - G1 jí nemá, ale obohacená cukry - posttranslační proteolýza: GO degradováno, G1 jen C-terminální část

Translokace mikrosomů - promytí solemi odstraní aktivitu, ale po přidání vymytého k mikrosómům obnovena aktivita - po několika hodinách při 0°C se aktivita ztrácí - Peter Walter frustrován... - stabilizuje nízká koncentrace detergentu Nikkol (zřejmě ochrání hydrofobní aktivní místo...) - izolace: 6 proteinů – „signal recognition protein“ (SRP) - ale komplex obsahuje také 7S RNA! - „signal recognition particle“ (SRP )

Mechanismus translokace mikrosomů... - SRP se s malou afinitou váží na Rb - ale s velkou afinitou, když mRNA pro sekreční protein (bovine preprolactin) - a neváží se, když mRNA pro cytosolické proteiny (globin) - hydroxy-leucin místo leucinu: skoro se neváže - signální sekvence preprolactinu bohatá leucinem - SRP interaguje se signální sekvencí - přidání SRP: zastavení translace mRNA sekrečních proteinů, ale ne cytosolických (velké cca 70 aa) - přidání mikrosomů: spuštění translace

SRP receptor - in vitro polysomy syntetizující sekreční proteiny se váží k mikrosomům jen v přítomnosti SRP - purifikace SRP receptoru ze solemi vymytých mikrosomů - 2 podjednotky – integrální membránový a periferní - obě GTP vazebné Reid Gilmore

Signální peptidáza - izolace enzymu – v detergentu aktivní (správná endoproteolýza presekretorických proteinů, nezávislé na translokaci) - komplex 5 různých podjednotek - integrální membránové proteiny Emily Evans

Protein-conducting channel (PCC) - transmembránový – do proteoliposomů - elekrofyziologická měření standardně k charakterizaci iontových kanálů, ale ne jiných - mohlo by vedení proteinu zvyšovat vodivost? Sanford M. Simon Christopher Nicchita

Charakterizace PCC 1 - přídavek drsných mikrosomů zvýšil vodivost, ale asi ne PCC

Charakterizace PCC 2 - puromycin – připojí-li ho Rb na nascentní řetězec – uvolní se do lumen ER - za nízké koncentrace solí: Rb zůstane přichycen – kanál volný - za vysoké koncentrace solí: Rb se odpojí – kanál se zavře

Charakterizace PCC 3 - přídavek puromycinu na cis- (trans-) stranu membrány:

Charakterizace PCC 4 velmi nízké koncentrace puromycinu – jednotlivé kanály zvýšení koncentrace solí zavře kanál vedou cca 10x víc iontů než běžné iontové kanály

Stavba PCC - Sec61 by mohl být PCC kvasinky (Stirling et al., 1992) - savčí protějšek PCC je heterotrimer – α,β,γ podjednotky Sec61 (Goerlich et al., 1992, 1993) - Roland Beckmann vyizoloval z kvasinčích mikrosomů komplex Sec61 a navázal na monomerní Rb

Vizualizace PCC - 2 Sec61 na 1 Rb - váže se na velkou podjednotku Rb - kanály propojené