Transgenoze: metody transformace rostlin, rekombinace

Vnesení genu transientní stabilní dochází / nedochází k integraci vnesené DNA do genomu Vnášená DNA se může začlenit do jaderné či organelové DNA (plastom, chondriom) pro expresi genu (= tvorba funkčního proteinu či RNA) v jiném organismu jsou nutné regulační sekvence rozpoznání transkripčním (a příp. i translačním aparátem) v organismu příjemce umožňují funkční přenosy genů i mezi vzdálenými organismy

TERMINÁTOR transkripce polyA mRNA TERMINÁTOR transkripce = polyA signál Transkripční faktor RNA polymeráza PROMOTOR Promotor: - určuje začátek a směr transkripce váže transkripční faktory – časově/místně specifická transkripce konstitutivní x inducibilní: ethanol, teplo, dexametazon, estradiol, … vedlejší účinky, částečná aktivita (leakiness) původ: rostliny, rostlinné patogeny (viry – JAKÉ?, agrobaktérium) - transkripce ale ovlivněna i místem integrace a stavem chromatinu (TGS)!

Translace mRNA stabilita transkriptu AACAATG terminační kodón mRNA kódující sekvence stabilita transkriptu (PTGS – polyA, počet kopií, introny) odlišné využívání kodónů u různých skupin organismů odlišné užívání kodónů v závislosti na kontextu (nukleozómy) charakter sekvence před iniciačním kodónem (Kozakové sekvence) přenos genů mezi baktériemi a rostlinami - cílená mutageneze pomocí PCR, …

Princip přípravy transgenních rostlin 1. Transformace jedné somatické buňky (vaječné buňky) 2. Pomnožení transformované buňky (zpravidla za selekčních podmínek) 3. Indukce organogeneze či somatické (zygotická) embryogeneze (často aplikací vhodných regulátorů rostlinného růstu v in vitro podmínkách) vnesení genu selekce organogeneze embryogeneze transformovaný kalus transformovaná buňka

Somaklonální variabilita - průvodní jev regenerací de novo (tedy i transformací) Příčiny: pretransformační x posttransformační somatické mutace (různého typu) somatické reaktivace TE epigenetické změny v somatických buňkách - samovolné či indukované při diferenciaci a následné de- a rediferenciaci (např. změny ploidie v důsledku působení růstových regulátorů - synt. auxinů)

Optimalizace transformačního protokolu rostlinného materiálu schopnost aktivace buněčného dělení (kalus) schopnost následné regenerace (!) genotyp, orgán, vývojové stádium, ošetření … metody přenosu DNA selekčního systému

Selekce transformovaných buněk (rostlin) Selekční geny - pouze transformované, rezistentní buňky se mohou dělit (a vytvořit rostlinu) - rezistence k antibiotikům (kanamycin, hygromycin) - k herbicidům (Roundup® - glyphosate, Liberty® - glufosinate) 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntáza, glutaminsyntetáza (produkt selekčního genu buďto degraduje selekční látku, či komplementuje zasaženou buněčnou funkci) - PMI (fosfomanóza isomeráza) – přeměna manóza-6-P na fruktóza-6-fosfát, … Reportérové geny (vizuální selekce transformantů): - GFP (zelený fluorescenční protein), - glukuronidáza, luciferáza, …

Selekční markery gen produkt genu princip selekce selekční agens nptII neomycinfosfotransferáza kanamycin hpt hygromycinfosfotransferáza hygromycin dhfr dihydrofolátreduktáza rezistence k antibiotiku methotrexát ble vazebný protein bleomycinu bleomycin cat chloramfenikolacetyltransferáza chloramfenikol bar fosfinotricinacetyltransferáza fosfinotricin (glufosinát) EPSP CP4 bakteriální 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntáza rezistence k herbicidu glyfosát deh1 dehalogenáza dalapon

Metody transformace „Přirozené“ metody via Agrobacterium modifikace metody: infiltrace (vakuová), floral dip pomocí rostlinného viru přechodná (transientní) transformace (DNA není začleněna do genomu) Biolistika („particle bombardment“, „microprojectile bombardment“) - modifikace: agrolistika (využití biolistiky a proteinů agrobaktéria) Direct gene transfer – přímé vnesení DNA do protoplastu: elektroporací působením polyethylenglykolu (PEG) Mikroinjekce do buněk

Přirozená transformace agrobaktériem (Agrobacterium tumefaciens) půdní baktérie G- (Rhizobiaceae), Ti plasmid „genetický parazitismus“ na dvouděložných rostlinách přenáší několik svých genů do rostlinných buněk v místě poranění z transformované buňky se tvoří nádor: ipt – isopentenyltransferáza iaaH – indolacetamidhydroláza transformované buňky tvoří výživné látky (opiny) pro agrobaktérium (nopalin/octopinsyntáza)

Přirozená transformace agrobaktériem

Upravené agrobaktérium geny způsobující vznik nádoru a syntézu opinů odstraněny – využívá se pouze schopnosti agrobaktéria přenášet T-DNA (definovanou hraničními sekvencemi) do rostlinných b. Ti plasmid rozdělen (na dva): T-DNA v malém podvojném (binárním) plasmidu vir geny (zodpovědné za přenos T-DNA) na helper plasmidu in trans) Binární transformační vektor Nezbytné sekvence: pro klonování v E. coli počátek replikace, selekční marker pro bakterie pro udržování (přenos) do agrobakteria: počátek replikace (příp. počátek konjug. přenosu) pro přenos do rostliny pomocí agrobakteria hraniční sekvence pro selekci transgenních buněk selekční marker pod „rostlinným“ promotorem

Vyštěpení T-DNA hraniční sekvence T-DNA: nedokonalá přímá repetice 25 bp: LB a RB = right, left border - jednovláknový zlom virD2 (D1/D2 dimer) - vytěsnění ssT-DNA opravnou replikací

Agrobakteriální infekce - produkty vir genů indukce exprese vir oblasti v reakci na fenolickou látku (VirA,VirG) štěpení na koncích T-DNA (VirD1, VirD2) tvorba póru pro mezibuněčný přenos (VirB1-11) ochrana T-DNA řetězce před degradací (VirE2) přenos T-DNA do jádra (VirE2 vazba na rostlinný transkripční faktor VIP, VirD2 s NLS vazba na importin KAP-α) cílená proteolýza proteinů T-DNA komplexu před integrací (VirF)

Integrace T-DNA do genomu - nehomologní rekombinace (illegitimní) - několik bází mikrohomologie s hraniční sekvencí v místě integrace - delece, přeuspořádání, filler (vyplňující) sekvence zachována zpravidla pravá hraniční oblast (chrání VirD2 protein) převládající způsob integrace DNA i u přímých metod transformace Alternativně: vytvoření dsT-DNA, navázání komplexu zajišťujícího ligaci do dvojvláknového zlomu DNA

Výhody transformace pomocí agrobaktéria poměrně vysoká frekvence stabilní transformace menší počet kopií (menší riziko umlčení exprese RNAi) možnost přenosu delších úseků DNA (až 45 kbp) Způsoby transformace pomocí agrobaktéria prostá kokultivace agrobaktéria s rostlinným pletivem, buněčnou kulturou, protoplasty in vitro infiltrace (vakuová/tlaková) agrobakteria do pletiva inokulace in planta (květenství, listy) pro transformaci jednoděložných rostlin a některých dalších je nutné indukovat vir geny agrobaktéria externě (acetosyringonem)

Transformace bramboru pomocí agrobaktéria vstup agrobaktéria do pletiva v místě poranění mikroskopický kalus agrobaktérium viditelné kalusy 3-4 týdny po transformaci kokultivace s poraněnými listy 5-6 týdnů po transformaci

Transformace Arabidopsis thaliana inokulace in planta (floral dip) Ponoření květenství s poupaty do suspenze agrobaktéria

Transformace Arabidopsis thaliana pomocí agrobaktéria cílem transformace je zpravidla vajíčko/vaječná buňka – z něj transformovaná embrya (semena) a následně rostliny transformovaná embrya - modře zbarvený produkt enzymové aktivity glukuronidázy, která byla použita jako reportérový gen

Agroinfiltrace tabáku (in planta) - předběžné testování exprese transgenů - bez nutnosti práce in vitro kotransformace s virovým supresorem silencingu (p19) k potlačení PTGS (vnesen GFP gen) se supresorem bez

Biolistická (biobalistická) metoda, transformace (Partickle gun, Gene gun) nabalení DNA na zlaté či wolframové kuličky nastřelení na rostlinný orgán, celé rostliny, buněčnou kulturu,... sítko

Biolistická metoda transformace nastřelování pomocí podtlaku či přetlaku (kombinace)

Biolistická metoda transformace univerzální použitelnost bez druhových limitací možnost transformace organel (plastidů) získání transformovaných rostlin podobné jako po transformaci agrobaktériem zlatá partikule (1 m) chloroplast (5 x 3 m)

Transformace chloroplastů - biolistickou metodou - vysoký počet kopií v genomu vysoké hladiny proteinu není silencing možnost cílení do určitého místa – homologní rekombinace plastidový genom je většinou nepřenosný pylem (pokud se nezačlení do jaderného genomu) Nevýhody: - nejsou eukaryotické posttranslační modifikace - příprava homoplasmických a nechimerických rostlin je časově náročná

Transformace chloroplastů Integrace rekombinací – transgen obklopený chloroplastovými sekvencemi Postupná selekce homoplasmických buněk a nechimerických rostlin

Agrolistika - varianta biolistiky 1. plasmid s geny pro proteiny VirD1 a VirD2 2. plasmid s hraničními oblastmi T-DNA ohraničujícími transgen a selekční marker - spíše zajímavá kuriozita; nevýhoda - integrace obou konstruktů (= i konstruktu s vir geny) - někdy také (nesprávné) označení postupu, kdy se biolistika použije k poranění buněk před kokultivací s agrobaktériem

pro transientní exprese proteinů Virové vektory pro transientní exprese proteinů episomální - neintegrují se do genomu (= není poziční efekt) - vyšší počet kopií - silná exprese - rychlá akumulace produktu - přirozené supresory silencingu (x PTGS) - systémové šíření rostlinou - často široké hostitelské spektrum

pro transientní exprese proteinů Virové vektory pro transientní exprese proteinů původně z Caulimovirů (např. CaMV) dsDNA genom - možnost sekvenčně modifikovat až 106 kopií na buňku, 3-4 týdny systémová infekce celé rostliny infekce mechanicky (odřením listu) ALE malá kapacita – inserty do 500 bp (polyhedrální kapsida) a polycistronní transkripty (komplikované úpravy sekvencí) - nevyužívají se v praxi

Virové vektory Virové vektory: - výhodnější helikální viry (vláknité, tyčkovité), např. TMV vyšší tolerance vůči větším insertům umožněno objevem RT - příprava cDNA (možnost sekvenčně modifikovat RNA viry) často se využívá k primární infekci agrobaktérium nesoucí T-DNA s cDNA viru – virový genom vzniká transkripcí Virové vektory: substituční (záměna za virový gen např. CP - CaMV) inserční (vnesený gen je navíc – např. TMV) modulární (vícekomponentové) – rozdělení na více replikonů (např. TMV, Geminiviry – polyhedrální!)

Přímá metoda - transformace protoplastů - odstranění buněčné stěny (bariéra přenosu DNA do buňky) – z mesofylových buněk, buněčných kultur - přenos přes buněčnou membránu podobně jako u živočišných buněk - regenerace buněk (vytvoření BS) a následná de novo regenerace rostlin je problematická (často nemožná) integrace většího množství kopií nepřesnost integrace (kopie často zkrácené, přeuspořádané)

Přímá metoda transformace protoplastů   PEG (polyethylen glykol) možno kombinovat s elektroporací  elektroporace podmínky elektroporace (napětí, délka a množství pulsů) závislé na průměru buňky lipozómy umělé lipidové váčky pro přenos DNA ochrana DNA před degradací DNázami přenos DNA do protoplastu fúzí či endocytózou 

Kotransformace x supertransformace transformace více vektory zároveň x následně (u agrobaktéria možné více T-DNA na jednom vektoru) optimálně každý vektor (T-DNA) nese jiný selekční marker (u kotransformace není nezbytné)

Inkorporace transgenu - ssT-DNA: nehomologní rekombinace (mikrohomologní) - dsDNA: oprava DSB (dvojřetězcový zlom DNA) prosté spojení konců DNA (nehomologní rekombinace) – pouhé spojení zatupených volných konců (často delece, translokace,..) – dominantní způsob u rostlin (většiny eukaryot) homologní rekombinace – integrace transgenů u kvasinek a plastidů a Physcomitrelly) – rekombinace mezi dvěma příbuznými sekvencemi – přesná bezchybná oprava (je-li správný „vzor“!) Homologní rekombinace – základní funkce crossing over při meiozi (homologní chromozómy) oprava DNA po poškození (sesterské chromatidy)

Homologní rekombinace extrachromozomální rekombinace rekombinace mezi dvěma vnášenými molekulami DNA - holé molekuly DNA i T-DNA komplexy: u rostlin frekvence 1 až 4 % 2. intrachromozomální rekombinace rekombinace mezi dvěma úseky DNA na tomtéž chromozómu - u rostlin frekvence 10-5 až 10-6 (není žádoucí) - pravděpodobně složitější mechanismus než u extrachromozomální rekombinace (nutné narušení struktury chromatinu)  3. gene targeting rekombinace mezi vnášenou DNA a cílovým místem na chromozómu (cílení integrace transgenu u kvasinek, plastidů, apod.) zasažený lokus

Frekvence homologní rekombinace (při inserci DNA s homologními úseky) poměr homologní/nehomologní rekombinace vyšší rostliny 10-3 až 10-6 (vysoká frekvence illegitimní rekombinace je překážkou pro homologní rekombinaci) savci 10-2 až 10-5 nižší eukaryota (kvasinky, prvoci, vláknité houby) nad 10% mech Physcomitrella patens 90% - vliv délky homologní sekvence, ploidie, buněčného typu, fáze buněčného cyklu, …

Stimulace přesné integrace transgenu homologní rekombinací: - expresí rekombinačních enzymů (i bakteriálních) represe či mutageneze genů účastnících se ilegitimní rekombinace, inhibice jejich produktů - vytvořením cílených DSB expresí místně specifické endonukleázy (viz dříve) (integrace i nehomologní rekombinací) nehomologní rekombinací - použitím místně specifických rekombinačních systémů prokaryot a nižších eukaryot (rekombináza/rozpoznávané cílové místo) Cre/lox bakteriofága P1 Flp/frt Saccharomyces cerevisiae R/RS Zygosaccharomyces rouxii

Reparace DSB Místně specifická inzerce transgenu (= GM) integrace transgenu s homologními koncovými sekvencemi (homologní rekombinací) - integrace nehomologní rekombinací v místě DSB Místně specifická mutageneze samovolná reparace (často s lokální delecí) - DNA templátem řízená mutageneze HOMOLOGNÍ REKOMBINACE

Cre/loxP - cílená integrace do místa předchozí inzerce - specifické vystřižení selekčního markeru: