Množení rostlin Ozdravování rostlinného materiálu Produkce umělých semen Produkce sekundárních metabolitů Biotransformace Šlechtění rostlin

Množení rostlin Ozdravování rostlinného materiálu Produkce umělých semen Produkce sekundárních metabolitů Biotransformace Šlechtění rostlin

Umělá semena (syntetická semena, SS) Princip: vytvoření umělých semen zapouzdřením somatických embryí vzniklých při kultivaci in vitro (alternativa: vzrostné vrcholy, úžlabní pupeny, segmenty stonku s pupenem) 1. somatická embryogeneze 1958 1. myšlenka na umělá semena 1977 1. úspěchy při konstrukci SS 1984 Důvody snahy o vývoj SS: výhody vegetativního množení vysoké ceny semen některých rostlin (viz nevýhody generativního množení in vivo) množení hybridů pocházejících z mezidruhových křížení --- hybrid životaschopný, semeno abortuje množení odrůd neprodukujících semena u rostlin jejichž semena ztrácejí rychle klíčivost Př: Některé nadějné plodiny: vojtěška, mrkev, kmín - dobře zvládnutá somatická embryogeneze květák, bavlna, salát, tabák, rajče – silný ekonomický tlak celer, káva

Schéma vývoje syntetických semen Umělá semena Schéma vývoje syntetických semen Indukce somatické embryogeneze Výběr vhodného výchozího materiálu Zrání somatických embryí Synchronizace somatické embryogeneze Zapouzdření som. embryí v gelovém pouzdře Produkce somatických embryí v bioreaktorech Odolný obal gelového pouzdra Mechanizace procesu zapouzdření Skladování syntetických semen Hodnocení syntetických semen ve skleníkových nebo polních podmínkách Převod na rostliny

Př: nodální segmenty olivy (Olea europaea) Klíčící somatická embrya bramboru odvozená ze somatických embryí uloženy do mikrokyvet (15mmx 15mm x45 mm) asi po 10 a s přídavkem umělého endospermu (kultivační médium se zeatinem a sacharózou) Možnost uchování 30 dní při normální teplotě

Př: Zapouzdřená somatická embrya: quava (Psidium guajava) Př: Zapouzdřené vzrostné vrcholy Solanum nigrum Uchovávání : 60 dní při 4°C Verna et al., 2010

Př. Decalepis hamiltonii (Asclepiadaceae) Zapouzdřené nodální segmenty Ohrožený rostlinný druh, tradiční léčivá popínavá rostlina domovem v Indii. Sharma and Shahzad, 2012

Výměna bezpatogenního materiálu Umělá semena Množení Uchovávání Transport Vzácné nebo ohrožené rostliny Elitní genotypy Geneticky modifikované rostliny Bezsemenné rostliny Komerčně důležité rostliny Výměna bezpatogenního materiálu Krátkodobé skladování Dlouhodobé skladování Zpomalený růst Kryoprezervace Nízká teplota Snížená ozářenost Růstové retardanty ABA Chudé médium Osmotikum Snížení O2 Zapouzdření - dehydratace Zapouzdření - vitrifikace Rai et al., 2009

Vývoj umělých semen Rai et al., 2009

Práce o uchovávání vybraných plodin založené na umělých semenech

Tkáňové a buněčné kultury Tkáňová kultura, kalus: neorganizovaně rostoucí masa buněk, relativně homogenní studiu růstu a vývoje, metabolismu rostlinných buněk (BY-2) množení rostlin šlechtění produkci sekundárních metabolitů Slouží : Vhodný výchozí materiál: listy, stonkové řízky, kořeny, řapíky, části květenství, sterilní semenáčeky; přednostně mladé, ne plně vyvinuté orgány: vzrostné vrcholy, nezralá zygotická embrya A : C Směs auxinů; 2,4 D Založení tkáňové kultury: zajistit dobrou výměnu plynů, příjem živin, ošetření R.R., (stonkové segmenty apikální částí do média --- podpoření přirozeného toku auxinů), někdy světlo, jindy tma, teplota 22-28 °C

Tkáňové a buněčné kultury Tkáňová kultura, kalus: neorganizovaně rostoucí masa buněk, relativně homogenní studiu růstu a vývoje, metabolismu rostlinných buněk (BY-2) množení rostlin šlechtění produkci sekundárních metabolitů Slouží : Vhodný výchozí materiál: listy, stonkové řízky, kořeny, řapíky, části květenství, sterilní semenáčeky; přednostně mladé, ne plně vyvinuté orgány: vzrostné vrcholy, nezralá zygotická embrya A : C Směs auxinů; 2,4 D Založení tkáňové kultury: zajistit dobrou výměnu plynů, příjem živin, ošetření R.R., (stonkové segmenty apikální částí do média --- podpoření přirozeného toku auxinů), někdy světlo, jindy tma, teplota 22-28 °C meristematická centra, shluky elementů vodivých pletiv, pigmentované buňky …. Ale!!! s postupujícím stárnutím kultury

Tkáňové a buněčné kultury Udržování: stejné médium jako pro indukci, subkultivační interval 1-3 týdny, pevná média, tekutá média, Špatný růst Nevhodné složení média, nevhodné fyzikální podmínky, nevhodný s.i.  vyčerpání média, nedostatečná difúze látek, akumulace toxických látek – oxidace fenolických látek  častější přesazování, aplikace antioxidantů

Tkáňové a buněčné kultury Udržování: stejné médium jako pro indukci, subkultivační interval 1-3 týdny, pevná média, tekutá média, Špatný růst Nevhodné složení média, nevhodné fyzikální podmínky, nevhodný s.i.  vyčerpání média, nedostatečná difúze látek, akumulace toxických látek – oxidace fenolických látek  častější přesazování, aplikace antioxidantů „conditioned media“ --- interakce mezi buňkami Problémová kultura Pomocná („nurse“) kultura Není lhostejné z jaké části rostliny byla kultura odvozena !! Stabilita determinovaného stavu: Během ontogeneze … determinace buněk… stabilní změny fenotypu, přetrvávající i v nepřítomnosti vlivu, který je vyvolal stabilita  trvalost

Suspenzní buněčné kultury Tkáňové a buněčné kultury Suspenzní buněčné kultury Založení buněčné kultury: převedení – nejčastěji - kalusu (tkáňové kultury) - do tekutého média Kalus rozpadavý – dobrý základ suspenzní buněčné kultury - kompaktní závislost na genotypu zlepšení rozpadavosti: modifikace media, častá subkultivace, polotekuté médium homogenizace, enzymatická separace použití primárního explantátu /např. list/ mechanické narušení, centrifugace, filtrace

Suspenzní buněčné kultury Tkáňové a buněčné kultury Suspenzní buněčné kultury Založení buněčné kultury: převedení – nejčastěji - kalusu (tkáňové kultury) - do tekutého média Kalus rozpadavý – dobrý základ suspenzní buněčné kultury - kompaktní závislost na genotypu zlepšení rozpadavosti: modifikace media, častá subkultivace, polotekuté médium homogenizace, enzymatická separace použití primárního explantátu /např. list/ mechanické narušení, centrifugace, filtrace Kultivace: Lag fáze : délka závisí na velikosti inokula - suboptimální – dlouhý lag, pomalý růst supraoptimální - zkrácení lagu, celkový nárůst se snižuje (ředění 1:4 až 1:10) Třepání - orbitální třepačka, roller Růstový parametr Čas Lag fáze Exponenc. fáze Stacionární fáze Exponenciální fáze: 3-4 generace, = 24-48 hod

Požadavky na ideální buněčnou kulturu: Realita: Tkáňové a buněčné kultury Požadavky na ideální buněčnou kulturu: Realita: agregace, diferenciace polyploidie, aneuploidie, chromozomové nepravidelnosti špatná synchronizace buněk ztráta morfogenetického potenciálu habituace homogenní suspenze jednotlivých buněk genetická, fyziologická, biochemická uniformita synchronizace buněčného dělení, prodlužování, diferenciace zachování regenerační schopnosti Pomůže: výběr materiálu s vysokou regenerační schopností testování vývojového a fyziologického stavu rostlin při založení kultury – schopnost organogeneze testování vlivu podmínek kultivace výběr vhodného subkultivačního intervalu

Typy bioreaktorů

Použití tkáňových / buněčných kultur pro šlechtění využití somaklonální variability působení mutageny Selekce negativní – auxotrofní mutanty pozitivní – rezistence k solím těžkým kovům herbicidům toxinům chladu osmotickému stresu antibiotikům analogům aminokyselin Př: lysin a threonin u obilnin a methionin a cystein u luštěnin jsou obsaženy v nízkých množstvích rezistence k threoninu  až 20x vyšší obsah, aspartátkináza necitlivá k alosterické inhibici konečným produktem

Postup šlechtění Omezení Odvození buněčné kultury (mutagenní zásah)   vystavení selekčnímu tlaku   izolace buněk vhodných vlastností   testování stability znaku   regenerace rostlin   genetická analýza regenerantů Omezení polygenní založení znaků znaky, které se projeví na celé rostlině nezvládnutá regenerace rostlin (ztráta při selekci) nestabilita získaných znaků epigenetické změny