Přenos jader Ne příliš úspěšné, přesto popsány intra- a interdruhové přenosy získány důkazy o funkci genů přeneseného jádra Přenos mikrojader Přenos mikrojader jádra obsahující jen část jaderného materiálu Získání: synchronizovaná kultura + mitotický jed, který ovlivňuje funkci vřeténka --- neorganizovaný přechod chromozomů do dceřiných buněk – část obsahuje jen např. 1-2 chromozomy Přenos chromozomů Izolace chromozomů - po synchronizaci - nejlépe v metafázi Přímá vazba na protoplasty pomocí fuzogenů (PEG – nízká frekvence přenosu) Mikroinjekce – vyšší frekvence – lepší regenerace při mikroinjekci do celistvých buněk ?? Osud přeneseného chromozomu, doba trvání v cytoplazmě, fáze buněčného cyklu recipientní buňky Přenos chloroplastů přenos špenátových chloroplastů do živočišných buněk 1971 – přenos do slepičích vajíček - přežívání, metabolická aktivita, dělení 1973 – komplementace protoplastů – fúze zelených protoplastů a mutantních s nevyvinutými plastidy – zelenání deficientních chloroplastů Přenos mitochondrií přímá vazba nebyla popsána přenos pomocí fúze protoplastů cytoplazmatičtí hybridi - znuvuuspořádání mt DNA – rekombinace Přenos částí buněk

Přenos izolované DNA (direct gene transfer) mnoho pokusů, chyběl důkaz integrace do recipientního chromozomu Množství způsobů přenosu DNA: Nevýhoda : vyšší frekvence přeorganizování transgenu a vyšší počet kopií  Elektroporací  Přenos pomocí působení PEG  Mikroinjekcí  Mikrobombardováním

Chemický „helper“  Poly L- ornitin – zpomaluje degradaci plazmidové DNA DNázami, stimuluje vazbu (neutralizací povrchového náboje) a expresi DNA v protoplastech  PEG, Ca 2+ zvyšuje vazbu DNA na povrch protoplastu  Krystalky fosforečnanu vápenatého- + fuzogen +  pH – endocytóza krystalků Lipozomy Lipozomy - fosfolipidy dispergované ve vodní fázi, podle podmínek a typu fosfolipidu různé uspořádání i náboj. Chrání DNA, nejlepší fosfatidylserin  Přenos pomocí působení PEG Elektroporace  Elektroporace V, ms, 2000 V, µs – narušení buněčné membrány, vytvoření pórů umožňujících vstup DNA do buňky (narušení membrány laserem) - buňky, pletiva, SE

lépe mikroinjekce do jádra (karyoplasty) –  degradace Koncentrace DNA -  vyšší koncentrace  zvýšení frekvence transformace, ale pozor !!  koncentrace toxické Forma DNA – lineární x nadšrobovicové (supercoil): lineární – vyšší frekvence transformace DNA lze přenášet mikroinjekcí i do mikrospor, celých buněk, semen  lepší přežívání a regenerace DNA Mikroinjekce  Mikroinjekce Imobilizace buněk: skelný povrch pokrytý polylyzinem, přidržovací pipeta

Biolistická metoda  Biolistická metoda (particle gun, particle bombardment) (1987) ostřelování rostlinné buňky projektily: DNA navázaná na inertní kov (wolfram, zlato) Co ovlivňuje výsledek ? Frekvence přežití buněk po transformačním působení Frekvence rekombinace + frekvence exprese Frekvence regenerace buněk za daných podmínek

Vektorový přenos DNA Virové vektory Dochází k rozšíření, zmnožení a expresi vloženého genu. Kromě patogenicity (např. nahrazení genu pro plášťový protein genem X) rekombinantní virus napodobuje svůj přirozený protějšek v ostatních aspektech možnost koexistence mnohočetných genů, je-li zachována schopnost autonomní replikace Řešení otázek :  Mechanismu infekce  Vliv na expresi jaderných genů  Interakce mezi různými viry  Rezistence k virům Lze použít k přenosu cizorodé DNA, neintegrující virové vektory systém Agrobacteria

Systém Agrobacteria Agrobacterium běžná půdní bakterie Dvouděložné po poranění a infekci – proliferační schopnost --- tvorba dediferencovaného tumorového pletiva nebo modifikovaných kořenů Agrobacterium tumefaciens – cown gall- halka Agrobacterium rhizogenes - hairy roots Izolace tumorových pletiv a přenesení do podmínek in vitro růst na médiu bez růstových regulátorů produkce nových látek – opinů a agropinů Čeleď Rhizobiaceae – všichni příslušníci ovlivňují morfologii rostlin, ale jen Agrobacterium mění genetickou výbavu rostlinných buněk

objeven plazmid, prokázána souvislost s virulencí Dělení podle produkovaných látek na jednotlivé typy:  oktopinový  nopalinový  manopinový  agropinový  agrocinopinový  leucopinový důkaz vnášení části genetické informace plazmidu do rostlinného genomu. Opiny - deriváty aminokyselin -- zdroj C a N pro bakterie -- konjugace mezi bakteriemi nejprostudovanější: oktopinový a nopalinový typ (deriváty argininu) Agropiny - deriváty cukrů -- zdroj C pro bakterie (stabilní, rostlinou nemetabolizovatelné)

Agrobacterium tumefaciens Ti plazmid Ti plazmid ( kb) T-DNA T-DNA - oblast ohraničená specifickými sekvencemi, přenášená do jádra rostlinné buňky Vir oblast T-DNA – nopalinový typ : geny kontrolující syntézu auxinů -“- cytokininů geny ovlivňující rychlost růstu tumorů geny pro syntézu nopalinů geny pro syntézu nosičových proteinů nopalinový typ T- DNA 1 segment (23kb) oktopinový typ T-DNA 2 segmenty (13,6; 7kb) T-DNA – oktopinový typ T R - syntéza oktopinů T L - tumorový růst T-DNA Z infikovaných buněk nelze regenerovat rostlinu Replikační počátek Katabolizmus opinů Konjugativní přenos

Vir-oblast Funkce nutné pro vystřižení, přenos a integraci T- DNA (vir oblast nopalinového a oktopinového typu mohou komplementovat) Vir-oblast není přenášena, zahrnuje několik operonů (vir A (1 protein); vir B (11); vir C (2); vir D (4) vir E (2) Vir G (1), (u některých kmenů vir F, vir H, vir J) A C G D E B konstitutivně Fenolická látka Poraněná rostlinná buňka Chv AChv B Psc A Syntéza a transport extracelulárních polysacharidů Vir oblast Ti plazmid Agrobacterium tumefaciens připojené k rostlinné buňce

Sled dějů při přenosu T-DNA do rostlinné buňky  Rozpoznání přítomnosti poraněné rostliny, signál: fenolické látky  chemotaxe  Připoutání bakteriální buňky k rostlinné b. - produkty chromozomálních genů (chvB tvorba  -1,2 glukanu; chvA – transportní protein – doprava do periplazmatického prostoru, pscA produkce sukcinoglykanu  Vazba signálních molekul na receptorové proteiny (vir A)  změna konformace proteinu vir A  aktivace vir G  Produkt genu vir G  aktivace genů vir oblasti  Vytvoření zlomu pro uvolnění T-DNA, vir D 1, vir D 2 odvíjení jednovláknové T-DNA vir D 1, vir D 2, Vir C 1  Vytvoření přenosového komplexu Vir E 2 Vir D 2  Přenos komplexu přes bakteriální a rostlinné stěny (geny vir B)  Vnesení T-DNA do buněčného jádra vir D 2, vir E 2  Integrace do jaderné DNA, přenos do náhodných míst rostlinného genomu

Agrobacterium rhizogenes Ri plazmid choroba – „hairy roots“--- zodpovědný Ri plazmid (root inducing) manopinový typ T DNA … jeden segment T-DNA agropinový typ T-DNA …. dva segmenty T-DNA Homologie Ti a Ri plazmidů Vnesené geny jsou nejaktivnější v dediferencovaných pletivech, z „hairy roots“ tumorů lze regenerovat rostliny, které jsou ovšem abnormální Téměř všechny kmeny A. rhizogenes mají 3 komponenty plazmidu Ri. malý plazmid: geny pro utilizaci opinů; střední plazmid: T-DNA a jiné geny pro utilizaci opinů velký plazmid: kointegrát obou předchozích T-DNA : geny pro syntézu auxinu, + rolB a rol C – interferující s metabolizmem r. hormonů   citlivost k endogenním auxinům.

Vektorový přenos při transgenozi a) onkogenní b) neonkogenní a) omezené využití, produkce tumorového pletiva u infekce Ti plazmidovou T-DNA nelze regenerovat dospělé rostliny T- DNA vnášený gen b) nevytváří se tumor – možná regenerace rostliny hraniční sekvence T- DNA vnášený gen hraniční sekvence T- DNA klonovací plazmid: replikační počátek T-DNA hraniční sekvence přenášený gen selektovatelný marker binární vektor Ti plazmid zbavený T-DNA

Transformační systém Společná kultivace protoplastů s Agrobacteriem Infekce listových disků Agrobacteriem Infekce rány na rostlině in vivo Agrobacteriem Ponoření vyvíjejících se květů do bakteriální kultury – selekce semen Přenesení vytvořeného kalusu na médium  odstranění Agrobacteria antibiotikem  růst tkáňové kultury  regenerace Přenos a exprese cizorodé DNA Možný přenos  jakékoli DNA (přeneseny až segmenty o 50kb) ?? Exprese genů - zachování regulátorových sekvencí genů; nutné iniciační a terminační sekvence funkční v rostlinné buňce Nevýhoda: nehodí se pro všechny rostliny a všechna pletiva (přednostně funguje u dvouděložných), jednoděložné výběr vhodného kmene, supervirulentní kmeny s více kopiemi některých Vir genů. Stabilita genů T-DNA: přenosné přes meiosi exprese genů se postupně snižuje - specifická vlastnost, která se projevuje jen při zachování T- DNA ( X transgenoze) zjištěna závislost mezi metylací a potlačením exprese Možnost vytvoření stabilních mutantů – využití ke šlechtění rostlin

Budoucnost a rizika Využití technik biotechnologie rostlin  pro rozvoj znalostí fyziologie rostlin  k praktickému využití ? Biotechnologie a životní prostředí  Množení rostlin Komerčně významné rostliny Ohrožené rostliny  Ozdravování rostlin ? Genetická uniformita ? Somaklonální variabilita  Mutageneze in vitro ? Genetická uniformita? Somaklonální variabilita  Produkce sekundárních metabolitů, biotransformace

Je snaha vnášet znaky související s 1. rezistencí k chorobám (k virům (pouzdrové proteiny); bakteriím; houbám) 2. rezistencí k parazitům (geny pro toxiny působící na škůdce, Bacillus thuringiensis) 3. rezistencí k herbicidům (modifikovaný cílový protein; nadprodukce cílového proteinu; detoxifikace herbicidu) 4. rezistencí k chladu, osmotickému stresu etc. (změny v obsahu osmoticky aktivních látek, stresových proteinů…) 5. zlepšením kvality produktů (změny v zastoupení a obsahu zásobních látek) 6. produkcí látek (farmaka, protilátky, vakcíny, technické látky, „ molecular farming“ ) ? Biotechnologie a životní prostředí ? Transgenní rostliny a životní prostředí

Rizika využívání transgenních rostlin Nebezpečí 1: Nebezpečí 1: transgenní rostlina se stává nekontrolovatelným plevelem (díky ovlivnění schopnosti přežití) typy rostlin : na lidech závislé lidmi dobře kontrolovatelné na lidech nezávislé Nebezpečí 2: Nebezpečí 2: přenos genu na divoké příbuzné rostliny možnost křížení překryv kvetení výskyt divokých příbuzných v dané lokalitě Nebezpečí 3: Nebezpečí 3: přenos genu na nepříbuzné rostliny (? viry, Agrobacterium) Nebezpečí 4: Nebezpečí 4: zvýšení používání herbicidů GMO in USA

Nebezpečí 7 Nebezpečí 7: porušení rovnováhy - vliv na divokou faunu, floru Nutnost  pečlivého výběru genu i recipientní rostliny  testování transgenních rostlin v uzavřených prostorách (skleníky)  sledování v polních pokusech za přísných bezpečnostních opatření ! Hodnocení každého jednotlivého případu zvlášť ! Nebezpečí 6: Nebezpečí 6: ovlivnění metabolizmu transgenní rostliny nežádoucím směrem Nebezpečí 5: Nebezpečí 5: hromadění látek v rostlinách, které mohou být toxické pro lidi nebo zvířata (herbicidy, toxiny, nové látky)

Nebezpečí 7 Nebezpečí 7: porušení rovnováhy - vliv na divokou faunu, floru Nutnost  pečlivého výběru genu i recipientní rostliny  testování transgenních rostlin v uzavřených prostorách (skleníky)  sledování v polních pokusech za přísných bezpečnostních opatření ! Hodnocení každého jednotlivého případu zvlášť ! Nebezpečí 6: Nebezpečí 6: ovlivnění metabolizmu transgenní rostliny nežádoucím směrem Nebezpečí 5: Nebezpečí 5: hromadění látek v rostlinách, které mohou být toxické pro lidi nebo zvířata (herbicidy, toxiny, nové látky)

Díky za pozornost