Solanum verrucosum Protoplasty 1971 - 1. normální rostlina z protoplastu - tabák 1972 - fúze protoplastů N. glauca X N. langsdorfii Greplová, Habásko, 2008 Význam: teoretický – regenerace rostlin; interakce vzdálených genomů praktický – zlepšení vlastností kulturních rostlin Výchozí materiál pro fúzi: protoplastové kultury velké množství rostlinných druhů protoplast  rostlina (i hospodářsky významné – brambor, rajče, tabák, vojtěška … i obilniny a dřeviny) Rozhoduje: genotyp typ pletiva, vývojová fáze rostliny výchozí materiál - výhodné in vitro rostoucí, mladé rostliny, mladá pletiva, kořenové špičky, dělohy, vzrostné vrcholy) suspenzní kultury - exponenciální fáze

Protoplasty Izolace protoplastů mechanicky – hypertonický roztok, narušení buněčné stěny (1892) chemicky – působením enzymů (1960) buněčná stěna – polysacharidy, celulóza, pektiny  celulázy, hemicelulázy, pektinázy !! Rozdíly ve stavbě b. stěny jedno- a dvouděložných rostlin – dvouděložné hodně pektinových látek Enzymatické působení: dvoukrokové, jednokrokové Podmínky – teplota 25-30°C, pH 6, tma, mírné třepání, 30 mi.. 20h Osmotikum – glukóza, sacharóza, manitol, sorbitol (10-20% roztoky) Př.:Okurka listy, hypokotyl: 1 % celulasa (Onozuka R 10) 0,25 % pektináza (macerozym R 10) kalus: 2% celulasa (Onozuka R 10) 1% pektináza (macerozym R 10)

Čištění – odstranění enzymů, odstranění zbytků buněk, buněčných stěn, … filtrace, centrifugace, promývání …. Kultivace inkubační médium nahrazeno kultivačním médiem (ne NH4+, Fe, Zn, Ca) citlivý proces – různé způsoby uspořádání (společná kultivace s rychle rostoucími protoplasty), tma, medium s auxiny a cytokininy  na agaru,  agaróze,  agarových bločcích v tekutém médiu,  v kapkách tekutého média,  imobilizace v alginátu,  „nurse cultures“

Regenerace protoplastů Protoplasty Regenerace protoplastů Spontánní proces -- různá schopnost regenerace u protoplastů z různých pletiv - dobrou regenerační schopnost vykazují protoplasty z mezofylových nebo hypokotylových buněk regenerace buněčné stěny (2-3 dny) 1. buněčné dělení (2-7 dní) vytvoření kalusu (tkáňové kultury 3 týdny) Optimální podmínky se liší pro různé genotypy světlo - nevyžadováno, někdy citlivost ke světlu, později stálé světlo --1000 luxů, teplota 25-30°C, V průběhu regenerace postupně snižovat obsah osmotika Organogeneze -přenesení na medium s růstovými regulátory.

Protoplastová fúze- somatická hybridizace Metoda kombinace genomů, která obchází sexuální inkompatibilitu Neexistence barier pro fúzi protoplastů Kombinace genomů i cytoplazmy (cybridi) Fúze protoplastů  fúze jader  regenerace buněčné stěny  buněčné dělení  tkáňová kultura  regenerace rostliny cestou organogeneze nebo somatické embryogeneze  Využití pro křížení sexuálně inkompatibilních druhů, sterilních nebo subfertilních druhů, druhů s přirozeně dlouhým životním cyklem Mezirodové a mezidruhové křížení, kombinace jak jaderného, tak mimojaderného materiálu

A B A + B A B A B A B A + B A A B B A B Chemicky indukovaná fúze Protoplastová fúze Chemicky indukovaná fúze Protoplasty nesou na povrchu záporný náboj, je třeba použít fuzogeny : PEG, Ca2+,  pH, 37°C, (výtěžek  1-2% fuzantů) A B PEG A + B A B A B A B Elektrofúze Působení elektrickým proudem (výtěžek  10 % fuzantů) Protoplasty jsou polarizovány střídavým proudem fúze indukována krátkým pulzem stejnosměrného proudu A B Vzniká mnoho typů fuzantů  problém výběru žádané kombinace A + B A A B B A B rezistentní Využití barevnosti protoplastů, rezistence k určitým podmínkám.. Vznikají amfidiploidi – diploidní jak mateřský, tak otcovský genom

A + B A + B A B A B Výběr vhodných fuzantů Tvar listů Tvar listů Impatiens neuguinea Tvar listů A + B A + B Chlorofyl - Chlorofyl - Chlorofyl - Chlorofyl - Petunia sp A B A B Tvar listů

A + B A + B A B A B A + B A + B A B A B Výběr vhodných fuzantů Impatiens neuguinea Tvar listů A + B A + B Chlorofyl - Chlorofyl - Chlorofyl - Chlorofyl - Petunia sp A B A B Tvar listů A + B A + B Nitrátreduktáza- Nitrátreduktáza- Mezofyl Okvětní lístky Resistence k antibiotikům, herbicidům, AK analogům, toxickým látkám A B A B „Označení“ fluorescenční barvou.. „Verifikace a charakterizace somatických hybridů: morfologické znaky , analýza izoenzymů, chromozomální charakteristika, molekulární techniky

+ + Subprotoplasty (centrifugace) a b Subprotoplasty: Protoplastová fúze Subprotoplasty (centrifugace) Subprotoplasty: a) velké, lehké, bezjaderné, s vakuolou cytoplasty  bezjaderné protoplasty  vakuoplasty b) malé, těžké, jádro obsahující miniprotoplasty  nukleoplasty  karyoplasty jádro a b valuola bez jádra, a tedy neschopné samostatné existence, využití – partneři pro různé typy fúzí málo cytoplasmy, ale plastom i chondriom řádně zastoupeny, vysoká metabolická aktivita, syntéza proteinů  jsou zcela životaschopné, zvětšují se, regenerují stěnu a dělí se. jádro Výhoda : po fúzi lze směs opět rozdělit centrifugací + Kombinace jader + Kombinace jader jednoho typu s cytoplazmou druhého chloroplasty

+ + + + + + Dělení směsi protoplastů po fúzi fúze Další využití : Protoplasty- protoplastová fúze Dělení směsi protoplastů po fúzi fúze + + + + + + Další využití :  karyoplasty - vhodné pro mikroinjekci  karyoplasty - výhodné při selekci na auxotrofii – rychlé vyčerpání poolu  karyoplasty – slouží ke studiu tvorby a vývoje vakuoly

x Stabilita somatických hybridů: Př.: Př.: Čím vzdálenější genotypy byly použity, tím menší je stabilita hybridů nepřežívají dochází k eliminaci jednoho z genomů vnitrobuněčná transgenoze ale !! kde není stabilní kombinace jaderného materiálu - může být stabilní kombinace chloroplastů a mitochondrií Př.: Nicotiana Petunia x Př.: Chloroplasty rezistentní ke streptomycinu, jádro zničeno  - zářením  - záření streptomycin Jádro Petunia eliminováno, kombinace cytoplazmy stabilní

Potenciál somatické hybridizace Produkce mezidruhových a mezirodových kříženců (kulturní odrůdy rýže x s divokými druhy; rajče X brambor) Hybridizace s cílem získání určitého znaku Rezistence k chorobám (Brassicaceae, Solanaceae; brambor rezistence – Phytophtora) Rezistence k abiotickým stresům (Fabaceae, Brassicaceceae, Poaceae, Solanaceae, odolnost k nízkým teplotám) Kvalita plodiny (Brassica napus X Eruca sativa ,  kys eruková)) Přenos cytoplasmatických znaků (samčí sterility, rezistence k herbicidům a antibitikům) Produkce autotetraploidů Produkce fertilních diploidů/ polyploidů ze sterilních haploidů, triploidů nebo aneuploidů Hybridizace rostlin v juvenilní fázi

Limitace somatické hybridizace nezvládnutá regenerace rostlin z protoplastů nedostatek vhodné selekční metody pro výběr fuzantů regenerovaný rostlinný materiál není životaschopný vývoj chimérických kalusů…(díky výskytu nefúzovaných jader) … pak ztráta chimérického charakteru při organogenezi mezirodoví hybridi jsou sterilní regenerované produkty jsou variabilní díky somaklonální variabilitě