Katedra biologických a biochemických věd FCHT, Univerzita Pardubice STUDIE VITAMINY Tomáš Roušar Katedra biologických a biochemických věd FCHT, Univerzita Pardubice

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar jen některé skladovány v těle  dostatečný stálý přívod potravou do organismu podílejí se na řadě dějů v organismu - enzymové systémy - hematopoeza - antioxidační působení při nedostatku  specifické potíže STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar LIPOFILNÍ HYDROFILNÍ VITAMIN A VITAMIN C TOKOFEROLY (α,β,γ) VITAMINY Sk. B VITAMIN K VITAMIN H STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar β-karoten vitamin C α-tokoferol STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení vitaminu E Vzorky plazmy (EDTA) Kalibrace Deproteinace (ethanol) Tokoferol acetát (200 μM) Extrakce (n-hexan) - 2x Odpaření v atmosféře N2 (60°C) Reziduum (-20°C) STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení vitaminu E HPLC analýza s UV detekcí - stac. fáze: MAC 4,6x250 mm, Biospher PSI 120, C18, 5 μm (Labio a.s., ČR) - mob. fáze: hexan-acetonitril-methanol 15:40:45, v/v/v - teplota: 37°C - průtok mobilní fáze: 0,7 ml/min - detekce: λ = 292 nm STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení vitaminu E Chromatogram vz. č.111: 7,20- vitamin E, 8,08- tok. acetát STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení vitaminu E y = 0,0047*x +1.72 R2 = 0.9993 yD = 6,46 μM STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení β-karotenu Vzorky plazmy (EDTA) Kalibrace BHT (0,1%) v n-hexanu Deproteinace (ethanol) Extrakce (n-hexan) - 2x Odpaření supernatantu v atmosféře N2 (60°C) Reziduum (-20°C) STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení β-karotenu HPLC analýza s VIS detekcí - stac. fáze: MAC 4,6x250 mm, Biospher PSI 120, C18, 5 μm (Labio a.s., ČR) - mob. fáze: hexan-acetonitril-methanol 15:40:45, v/v/v - teplota: 40°C - průtok mobilní fáze: 0,7 ml/min - detekce: λ = 450 nm STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení β-karotenu Chromatogram kalibrace: 6,93- vitamin E, 12,67- β-karoten STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení β-karotenu y = (8,60*10-5)*x +0,02 R2 = 0.9997 yD = 0,12 μM STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení vitaminu C Vzorky plazmy (EDTA) Kalibrace + DTT (DTE), MPA TCA, oxalová kys. Deproteinace TCA (10%), kys. oxalová (10 mM) Centrifugace (5000 rpm; 10 min) STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení vitaminu C Extrakce (diethylether) – 3x Supernatant Vodná fáze (obsahuje kyseliny) (vitamin C, ostat. l.) Rozpuštění ve směsi EDTA (1mM): methanol [7:3] Dávkování na kolonu STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení vitaminu C HPLC analýza s elektrochemickou detekcí - stac. fáze: kolona - 4x150 mm, Discovery, C18, 5 μm (Supelco, USA) předkolona - 4x20 mm, Discovery, C18, 5 μm (Supelco, USA) - mobilní fáze: methanol-voda 20:80, v/v - ionpárující činidla - dodecyltrimethylammonium chlorid - tetraoctylammonium bromid - T = 20°C; průtok = 0,5 ml/min STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení vitaminu C Chromatogram vzorku: 5,33- kys. močová, 6,54- vitamin C STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení MDA Vzorky plazmy (EDTA) Kalibrace 16,6 μl TMP/ 1 l H2O TBA (28 mM) + EDTA (2 g/l) 100°C, 60 minut STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení MDA Extrakce (n-butanol) Třepání a centrifugace (3500 rpm, 4°C, 45 min) Spektrofotometr (485 nm; 532 nm; 560 nm) Allenova korekce Akor = A532 – [(A560 - A485)*0,63 + A485] STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Stanovení MDA y = 0,020*x +0,002 R2 = 0.9999 xD = 0,19 μM STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Výsledky: Vitamin E ± SD [μmol/l] MDA Kontrolní skupina 13,39 ± 4,23 0,71 ± 0,26 Infarkt myokardu 14,59 ± 5,39 0,72 ± 0,35 Diabetes Mellitus 14,92 ± 5,12 0,88 ± 0,29 STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Výsledky: 87 účastníků studie (prům. věk = 74 let) hladiny vitaminu E mezi kontrolní skupinou a skupinami ostatními se statisticky významně neliší hladiny MDA se v porovnání s kontrolní skupinou liší významně u skupiny s diabetem mellitem, rozdílné nejsou u skupiny s IM STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar

STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar Děkuji za pozornost ! STUDIE VITAMINY, © 2003 T.Roušar