Terapeutická angiogeneza při kritické ischemii dolních končetin prostřednictvím autologní transplantace krvetvorných buněk (projekt MZ SR 2006/36-MFN-03) J. Hudeček, Ľ. Laca, R. Talapková, P. Kubisz, I. Šinák Klinika hematológie a transfuziológie JLF UK a MFN Klinika transplantačnej a cievnej chirurgie JLF UK a MFN Slavnostní zasedání vědecké rady JLF UK v Martine 24. 9. 2009

Celulární terapie využívá multilineární diferenciační potenciál pluripotentních kmenových buněk (plasticitu kmenových buněk) k rekonstituci různorodých tkání mezenchymální kmenové buňky (MSC) identifikace − CD133+/CD34- produkují řadu cytokinů (např. IL-6, GM-CSG, G-CSF), modulují imunitní reakce (T-bb.) zdroj MSC: fetální tkáně, pupečníková krev, KD výskyt MSC v periferní krvi je extrémně nízký Jing Y, et al.: Nature 2002; 418: 41-49

Implantace MSC iniciální fáze uvolňování cytokinů a trofických faktorů ► usnadnění regenerace tkání, záchrana částečně poškozených buněk fáze formování diferenciace MSC do buněk určité tkáně (induktivní vliv mikroprostředí tkáně) působení MSC je komplexní !!!

Terapeutická angiogeneza a kritická ischemie dolních končetin kritická ischemie DK – chronická ischem. bolest vyžadující pravidelnou léčbu analgetiky trvající více jak 2 týdny s kožními defekty a/nebo gangrenou terapie: - otevřené chirurgické techniky - endovaskulární rekonstrukce - konzervativní léčba ► amputace končetiny - terapeutická angiogeneza

Novotvorba cév angiogeneza arteriogeneza vaskulogeneza novotvorba kapilární sítě pučením endotelií hypoxie, HIF-1 remodelace arteriol do kolaterálních arterií zvýšený smykový stres vaskulogeneza primární tvorba kapilární sítě progenitorové buňky

Hemangioblast hypotetický mezodermální společný prekurzor hemopoetických kmenových buněk (HSCs) a endotelitálních progenitorových buněk (EPCs) EPCs se po implantaci do ktáně diferencují ve zralé endotelie (vaskulogeneze) a zvyšují hustotu kapilár Deans RJ, et al.: Exp Hematol 2000;28:875-884

Hemangioblast hemangioblast pluripotentní kmenová buňka (MSC) CD133+/CD34- CFU-GEMM CD133+/CD34+ lymfoidní kmenová buňka CD133+/CD34+ hemopoetická kmenová buňka CD133+/CD34+ hemangioblast

Naše východiska přípravy suspenze kmenových buněk a jejich aplikace výskyt MSC je vyšší v CD34+ frakci KD než v CD34- Noort WA, et al.: Blood 2001;98:295a celularita KD se s věkem snižuje Buckner CD, et al.: Blood 1984;64:630-634 kmenové buňky KD mohou být skladovány v tekutém stavu po 2 – 9 dnů bez významného poklesu jejich počtu a viability Wannesson L., et al.: Ann Oncol 2007; 18: 623-632 hustota bb. je rozhodujícím faktorem ovlivňujícím růst jejich populace – v.s. nejen v podmínkách in vitro ► lokální aplikce MSC je účinnější než podání systémové Lazarus HM, et al.: Bone Marrow Transplant 1995;16:557-564

Kostní dřeň – zdroj kmenových buněk pro celulární terapii

Příprava suspenze kmenových buněk diferenciační centrifagací (1) odběr 600 ml KD fyziologický roztok obsahující heparin (80 IU/ml) poměr antikoagulans : KD = 1 : 3 vak na odběr KD (Baxter) filtrace suspenze KD přes 500μm a 200μm filtr rozdělení obsahu sběrného vaku (cca 800 ml suspenze KD) do 2 čtyřvaků na odběr krve (Baxter; CPD+SAG-M byl vypuštěný)

Příprava suspenze kmenových buněk

Příprava suspenze kmenových buněk diferenciační centrifugací (2) centrifugace vaků ve velkoobjemové centrifuze (Cryofuga 6000; Heraeus) – 20 min., 3100 ot./min., 22oC oddělení buffy coatu (koncentrátu kmenových bb.) po centrifugaci na poloautomatickém lisu na krevní vaky (Optipress 1; Baxter) – objem kavity stacionární desky 60 ml skladování koncentrátu suspenze KD při +4oC koncentrát je aplikovaný maximálně do 16 hod. od jeho přípravy

Koncentrát suspenze KD 100 – 120 ml suspenze KD

Terapeutická angiogeneza Novoa E, et al., 2006; Soda T, et al., 2007 2 ml suspenze KD i.m.

Cíl projektu a hodnocení efektu terapeutické angiogenezy záchrana ischemické končetiny před vysokou amputací (v oblasti bérce) zhodnocení bezpečnosti tohoto způsobu léčby stanovení kritérií pro indikaci terapuetické angiogenezy za 1, 3, 6 a 12 měsíců: subjektivní hodnocení (dotazník – klaudikace intenzita bolestí, hybnost, analgetika, kvalita života) objektivní hodnocení – hojení lézí, pletyzmografie, ABI za 6 a 12 měsíců: digitální subtrakční angiografie

Charakteristika suspenze kmenových buněk Soubor nemocných 15 nemocných – 12 mužů, 3 ženy medián věku: 67 let (44 – 82 let) délka sledování: 3 – 24 měsíců Charakteristika suspenze kmenových buněk CD34+ bb. v KD: 75,3 . 106/l CD34+ bb. v suspenzi: 390,4 . 106/l (5,2x) CD133+/CD34- bb. v KD: 15 . 106/l CD133+/CD34- bb. v suspenzi: 89,8 . 106/l (6x)

Pacient R.T., 76 let Dg.: Obliterující ateroskleroza tepen DK 2/08 7/08

Výsledky počet dobrá tolerance léčby 15 analgetický účinek (bez bolestí) 11 (3) zmenšení lézí (zcela zhojený defekt) 5 (3) zlepšení hybnosti (bez klaudikací) 7 (2) komplikace léčby velká amputace/malá amputace 3/3 jeden nemocný zemřel za měsíc po léčbě (úmrtí nesouviselo s terapeutickou angiogenezou)

Závěr příprava suspenze KB diferenciační centrifugací je jednoduchou a technicky nenáročnou metodou zabezpečující požadavky terapeutické angiogenezy na zdroj KB autologní celulární terapie je potenciálně úspěšná a bezpečná metoda na zlepšení prokrvení u kritické končetinové ischemie otázky: Jak dlouho bude přetrvávet efekt léčby ? Bude opakování terapie stejně úspěšné ?

Klinika hematológie a transfuziológie JLF UK a MFN, Martin J. Hudeček, J. Fedorová, Ľ. Babinská, J. Staško, P. Kubisz Hematologické a transfuziologické oddelenie KNsP, Čadca J. Grochal, J. Polková Klinika transplantačnej a cievnej chirurgie JLF UK a MFN, Martin R. Talapková, I. Šinák, Ľ. Hlinka, Ľ. Laca