Principy fotometrických metod mirka.rovenska@lfmotol.cuni.cz

Interakce záření s hmotou Dopadá-li záření na vzorek (látku), pak: a) některé fotony se vzorkem neinteragují a procházejí jím b) některé fotony jsou vzorkem absorbovány c) některé fotony jsou vzorkem rozptýleny d) některé fotony jsou vzorkem odraženy Zastoupení a) – d) závisí na látce vzorku a na vlnové délce záření Při spektrofotometrických měřeních mají c) a d) být minimální dopadající záření odražené záření rozptýlené záření prošlé záření absorpce záření I0 I Intenzita prošlého záření (I) je tedy menší než intenzita záření dopadajícího (I0)

Spektrum elektromagnetického záření 10-12 10-10 10-8 10-3 10-1

Absorpce záření Molekuly vzorku absorbují z dopadajícího záření fotony vhodné vlnové délky λ a přecházejí do vyššího energetického stavu: 1) fotony mikrovlnné a vzdálené IČ oblasti mají tak malou energii, že jejich absorpce může zvýšit jen energii rotačního stavu skupin v molekule 2) absorpce fotonu střední a blízké IČ oblasti může vyvolat přechod do vyššího vibračního stavu molekuly 3) ve viditelné a UV oblasti mají fotony energii dostatečnou k tomu, aby jejich absorpce způsobila přechod elektronů na vyšší energetickou hladinu http://uk.video.search.yahoo.com/search/video?rd=r1&p=molecular+vibration&toggle=1&cop=mss&ei=UTF-8&fr=yfp-t-702

Diagram energetických hladin molekuly energie elektronové hladiny 1. excitovaný stav elektronu vibrační hladiny rotační hladiny UV/VIS IČ vzdálené IČ ΔE = ΔEe + ΔEv + ΔEr ; ΔE = hν = hc/λ ΔEe >> ΔEv >> ΔEr ΔEe ΔEv Změna elektronového stavu je tedy provázena změnou vibračního i rotačního stavu!

Barevnost látek Jako barevné se jeví látky, které absorbují ve viditelné oblasti Barva vzorku je pak dána odraženým zářením (látka má barvu komplementární k té, která byla absorbována):

Chromofory Absorpcí VIS mohou na vyšší hladinu přecházet π nebo n elektrony (σ ne – vyžadují UV); barevné tedy jsou ty látky, které obsahují π nebo n elektrony Skupiny obsahující násobné vazby a nevazebné elektronové páry se nazývají chromofory – např.: Aby látka byla barevná, musí obsahovat několik chromoforů (absorpční maximum se tím posouvá k vyšší λ, tj. z UV do VIS): Barevné tedy NEbudou látky, které absorbují jen UV (nasycené uhlovodíky)

Absorpce UV, VIS UV/VIS absorpce se bude týkat i celý další výklad Nejběžněji se v biochemii využívá měření absorpce UV a VIS, která způsobuje elektronové přechody UV/VIS absorpce se bude týkat i celý další výklad

Lambertův-Beerův zákon dopadající záření odražené záření rozptýlené záření prošlé záření absorpce záření I0 I l Při průchodu záření vzorkem dochází k zeslabení jeho intenzity Toto zeslabení je dáno poměrem intenzity záření prošlého a záření dopadajícího, který se označuje jako transmitance: T = I/I0 T nabývá hodnot 0 – 1 (0 – 100%) a udává, jaká část vstupujícího záření vychází ze zkoumaného prostředí Látky, u nichž se T (v oblasti VIS) blíží 100%...průhledné; 0%......neprůhledné

A = ελ c l Absorbance je pak definována jako: A = - log T = log I0/I Látkám s velkou propustností tedy přísluší malá absorbance Podle Lambertova-Beerova zákona je absorbance při dané λ úměrná tloušťce absorbující vrstvy (l) a molární koncentraci (c) absorbující látky: A = ελ c l ε…molární absorpční koeficient [dm3mol-1cm-1] = [M-1cm-1] Tento zákon platí jen pro monochromatické záření! ε závisí na λ a tato závislost charakterizuje danou látku

Absorpční spektrum Spektrum je obecně závislost intenzity elektromagnetického záření na jeho vlnové délce či frekvenci (ν = 1/λ) Absorpční spektrum získáme analýzou záření ze zdroje po průchodu danou látkou (porovnáním intenzity původního a prošlého záření) Absorpčním spektrem dané látky se často rozumí závislost její absorbance nebo ε na λ Spektrofotometrie = obor, který se zabývá studiem absorpčních spekter KMnO4 A

Charakteristiky absorpčního pásu λ [nm] Absorbance (relativní jednotky) λ1max λ2max Absorpční pás je charakterizován: vlnovou délkou λmax odpovídající jeho maximu – při ní se obvykle měří A příslušným absorpčním koeficientem εmax

Příklad 1: Lambertův-Beerův zákon Známe-li ε a tloušťku vrstvy (tzn. šířku kyvety), můžeme z naměřené absorbance pomocí L-B zákona určit koncentraci absorbující látky Např.: Kolik g vitamínu D2 obsahuje 1 litr roztoku, naměříme-li v kyvetě o tloušťce 2 cm absorbanci A264 = 0,4 a ε je pro vit. D2 při této λ roven 18,4 [dm3mol-1cm-1]; molární hmotnost vitamínu D2 je 396 g/mol. A = ελ.c.l  c = A / (ελ.l) = 0,4 / (18,4 . 2) = 0,01 M m = c . M . V = 0,01 . 396 . 1 = 4,3 g

Kalibrační přímka V praxi může být přesnějším způsobem, jak zjistit koncentraci absorbující látky, použití kalibračního grafu: sestrojí se graf závislosti absorbance na koncentraci absorbující látky (změřením A pro několik námi připravených vzorků, u nichž koncentraci stanovované látky známe, při vlnové délce abs. maxima) změří se absorbance neznámého vzorku a pro ni se z kalibračního grafu odečte příslušná konc.

Příklad 2: určení konc. z kalibrační přímky Pro stanovení celkové konc. bílkovin se užívá mj. Lowryho metoda, při níž reakcí proteinů s činidlem vzniká barevný komplex, který absorbuje při λ= 750 nm Připraví se několik vzorků čistého proteinu, např. BSA (bovine serum albumin) tak, že výsledná konc. BSA ve vzorku je 5, 10, 20, 40, 60 a 80 µg/ml. Přidá se činidlo. Změří se absorbance těchto vzorků při 750 nm a z nich se sestrojí kalibrační graf: Stejným postupem se připraví vzorek, v němž chceme stanovit koncentraci proteinů, změří se jeho A750 a pro ni z grafu odečte příslušná hodnota konc.: např. pro A = 0,3 je koncentrace proteinů 50 µg/ml (lze též vypočítat z rovnice přímky)

Příklad 3: sledování enzymatických reakcí Spektrofotometricky se sleduje nárůst koncentrace produktu resp. úbytek koncentrace substrátu enzymové reakce za čas Často se měří (spřažené) reakce, v nichž je koenzymem NAD+/NADH+H+; využívá se rozdílu v absorpčních spektrech obou koenzymů: Např: stanovení acetoacetátu a -hydroxybutyrátu: jejich poměr v arteriální krvi je obrazem intramitochondriálního redox stavu a používá se pro posouzení energ. stavu jater při transplantacích, resekcích nebo selháních: molární [M-1cm-1] Při 340 nm se měří nárůst/úbytek NADH za určitý časový interval a porovnává se s kalibrací -hydroxybutyrát + NADH + H+ acetoacetát + NAD+

Jak a čím se vlastně A měří? Nejběžnější je spektrofotometr, který se skládá z: Zdroj obvykle vysílá polychromatické záření (obsahuje více λ), z něhož se v monochromátoru (hranol nebo mřížka + štěrbina) vymezuje monochroma-tický paprsek (jedna λ) Jako zdroj VIS se používá wolframová lampa, jako zdroj UV např. deuteriová výbojka hranol štěrbina zdroj záření detektor počítač vzorek registrační přístroj monochromátor

Spektrofotometry Před měřením vlastních vzorků je nutno proměřit „blank“, tj. roztok obsahující vše, co budou obsahovat vzorky (pufr, koenzym…), až na absorbující látku – jeho A se pak odečte od naměřených absorbancí vzorků I tak by ale rozpouštědlo mělo danou λ absorbovat co nejméně Roztoky nesmí být zakalené, nehomogenní, nesmí obsahovat bubliny… Přijatelnou chybu má měření A v intervalu 0,1-1; při A > 1 musíme vzorek zředit a A změřit znovu!

Kyvety Kyvety musí být z materiálu, který neabsorbuje používané záření  kyvety pro měření ve VIS oblasti mohou být skleněné, kyvety pro měření v UV musí být křemenné

Měření absorbance v destičkách Chceme-li měřit A pro více vzorků najednou, můžeme je napipetovat do jamek destičky a celou destičku proměřit ve čtečce („microplate reader“):

ELISA – sendvičové provedení pozitivní vzorek negat. kontrola Ag Ab proti značená Ab wash → measurement of A ELISA=enzyme-linked immunosorbent assay Do jamky destičky se adsorbuje antigen (Ag) Přidá se vzorek, v němž stanovujeme protilátku (Ab) proti antigenu; pokud je ve vzorku obsažena, naváže se na antigen v jamce Po odmytí nenavázaných složek přidáme sekundární protilátku, která rozeznává daný izotyp protilátek Tato sekundární protilátka je značená enzymem (E), jenž po přidání substrátu (S) katalyzuje vznik barevného produktu, který stanovíme spektrofotometricky Postup může být i opačný: do jamek se adsorbuje protilátka, která vyváže Ag ze vzorku, a pak se přidá jiná, značená protilátka proti Ag Ab proti Ag značená Ab E S barevný produkt

Příklad: screening infekce HIV Vyšetřuje se přítomnost protilátek proti HIV v séru pacienta: do jamky se absorbuje antigen – komerčně dostupný protein viru (např. protein virového obalu) a přidá se vzorek séra; došlo-li k infekci, sérum obsahuje protilátky proti virovým proteinům a ty se naváží na antigen po promytí se přidá enzymem značená sekundární Ab, která se váže na protilátky pacienta přidá se substrát, jenž je enzymem přeměněn na barevný produkt protein HIV Ab proti sekundární Ab pozitivní negativní promytí → přidání substrátu → měření A barevného produktu

Turbidimetrie a nefelometrie Turbidimetrie je metoda, při které se měří pokles intenzity PROŠLÉHO záření oproti záření vstupujícímu, k němuž dochází rozptylem na částicích SUSPENZE (např. precipitátu) Obdobou absorbance je turbidance: Za určitých podmínek je při použití monochromatického záření turbidance přímo úměrná součinu koncentrace a tloušťky vrstvy (obdoba L-B zákona) I turbidanci lze měřit spektrofotometry; detektor je ve stejné ose jako zdroj a kyveta: S = log I0/I detektor I0 prošlé záření kyveta zdroj

Měří se tedy pomocí nefelometrů: Nefelometrie měří intenzitu ROZPTÝLENÉHO záření (k rozptylu opět dochází na částečkách SUSPENZE), vystupujícího z kyvety KOLMO na směr paprsků ze zdroje: Měří se tedy pomocí nefelometrů: zdroj I0 kyveta rozptýlené záření detektor

Použití turbidimetrie a nefelometrie V klinické praxi se nejčastěji užívají ke stanovení diagnosticky významných proteinů v krvi: přidá se protilátka proti stanovovanému proteinu (antigenu) a sleduje se vznik imunokomplexů antigen-protilátka (tvoří se precipitát) např.: stanovení CRP (C-reaktivní protein): konc. stoupá při akutním zánětu, nejvíce při bakteriálních infekcích x u virových infekcí bývá jen zřídka výrazné zvýšení CRP…využití v diagnostice stanovení IgG, IgA a IgM: změny v konc. jednotlivých izotypů mj. napomáhají v diferenciální diagnostice chronických onemocnění jater; další využití: diagnostika imunodeficiencí, autoimunitních chorob