Interní oddělení NsP Havířov HEMOLYTICKÉ ANÉMIE HEMOLYTICKÉ ANÉMIE Michal Folwarczny Interní oddělení NsP Havířov

Erytrocyt za IDEÁLNÍCH PODMÍNEK přežívá 120 dní Fyziologie Erytrocyt za IDEÁLNÍCH PODMÍNEK přežívá 120 dní Extrakorpuskulární podmínky 1. Fyzikální 2. Chemické 3. Biologické - cizí - vlastní Korpuskulární podmínky 1. Membrána 2. Metabolismus 3. Vnitřní struktura - hemo-globin

Atlas fyziologie člověka, S.Silbernagel ANÉMIE HEMOLÝZA - intravaskulární - extravaskulární HEMOLYTICKÁ HEMOLYTICKÝ SYNDROM Atlas fyziologie člověka, S.Silbernagel

DEFEKT VNITŘNÍ MEMBRÁNY ČI METABOLISMU Enzymopatie Hemoglobinopatie Talasemie ZTRÁTA INTEGRITY MEMBRÁNY, CYTOSKELETU Hereditární sferocytóza, eliptocytóza… Paroxyzmální noční hemoglobinurie Imunitní a lékově vázané HA ZEVNÍ FAKTORY Mechanické trauma, Mikroangiopatické vlivy Chemické, fyzikální a biologické vlivy

Klinické projevy - obecně

Laboratorní algoritmus 3 ZÁKLADNÍ OTÁZKY 1. Průkaz hemolýzy 2. Typ hemolytického mechanismu 3. Konečná diagnóza

Průkaz hemolýzy haptoglobin v séru hemopexin v séru KO mikroskopicky RTC, retikulocytový index nekonjugovaný bilirubin urobilinogen a hemoglobin v moči hyperplastická erytropoéza, vysoký počet sideroblastů, polychromázie, bazofilní tečkování erytrocytů haptoglobin v séru hemopexin v séru (hemosiderin v moči)

Hemolytický mechanismus Přímý antiglobulinový test Testy na Coombs negativní HA Vyš. Hb v moči Volný Hb v séru

Při podezření na vrozenou hemolytickou anémii Přesná diagnóza Při podezření na vrozenou hemolytickou anémii Osmotická rezistence po 24 hodinové inkubaci při 37°C Nestabilita při 45°C Screening G-6-PD Aktivity enzymů: především pyruvát-kináza Měření glutathionu Kryohemolytický test Elektroforéza Hb - Měření HbA2, HbF a jiné Průkaz proteinů erytrocytové membrán /spektrin atd./ a cytoskeletu gelovou elektroforézou nebo RIA

Při podezření na autoimunitní HA Přesná diagnóza Při podezření na autoimunitní HA Přímý a nepřímý antiglobulinový test Specifikace antierytrocytárních protilátek Titrace chladových aglutininů Donath-Landsteiner test Průkaz teplotního optima protilátek Eluční testy

Při podezření na polékový mechanismus Přesná diagnóza Při podezření na polékový mechanismus Skríningové vyš. pro G6PD Vyš. glutationové stability Barvení na Heinzova tělíska Průkaz methemoglobinu Průkaz sulfhemoglobinu Vyš. na drug-dependent protilátky

Při podezření na mechanickou příčinu Přesná diagnóza Při podezření na mechanickou příčinu Morfologie erytrocytů Počet trombocytů Koagulační skrínink V nejasných případech Vyš. pro PNH: acidifikační test – Hamův test, test lýzy po přidání glukózy, průtoková cytometrie, gelový test Měření přežívání erytrocytů značeným chromem Určení místa hemolýza metodami nukleární medicíny

Hereditární sferocytóza Incidence 1/2500-1/5000 AD (vzácně recesivní) onem. s variabilní expresivitou genu – variabilní klinika DIAGNOSTIKA: - různé počty sférocytů, různě těžká norm.norm an. ,není přítomná anizocytóza - KD – hyperplazie eryrtropoézy, příležostně megaloblastoidní rysy - osmotická rezistence ery snížená - autohemolýza je zřetelně zvýšená a snižuje se po přidání glukózy /ne ATP/ známky extravaskulární hemolýzy kryohemolytický test KOMPLIKACE: - HEMOLYTICKÁ KRIZE A APLASTICKÁ KRIZE

Hereditární sferocytóza Prenatální diagnostika osmotickou fragilitou Near-total splenectomy Hledání korelace genotyp-fenotyp v rámci výběru vhodné strategie

Erytrocytární enzymopatie

Erytrocytární enzymopatie DEFEKT ENZYMŮ ANAEROBNÍ GLYKOLÝZY → deficity pyruvát kinázy – chronická hemolytická anémie s malým efektem splenektomie DEFEKT ENZYMŮ PENTOSOVÉHO CYKLU → deficit glukoso-6-fosfát dehydrogenázy - zvýšená citlivost k oxidačním činidlům – chronická hemolýza či hemolytická krize – anémie s Heinzovými tělísky

Defekt pyruvátkinázy chronická nesfrerocytová HA, autozomálně recesivní vyšší výskyt v severní a střední vropě PŘÍTOMNÁ ANÉMIE JE VĚTŠINOU DOBŘE TOLEROVÁNA - METABOLICKÝ BLOK NASTÁVÁ AŽ ZA VZNIKEM 2,3-DPG vysoce variabilní průběh – lehký ikterus po těžkou aplasticou krizi DG: převaha normocytárních, někdy lehce makrocytární RTC středně nebo lehce zvýěšené Polychromázie, anizocytóza, ojed. normoblasty Test autohemolýzy je patologický, úprava po ATP Diagnóza se opírá o průkaz snížené aktivity enzymu. TH: Symptomatická terapie Transfúze, splenektomie, chelatace Raritní dřeňová transplantace

Defekt G-6-PD vazba na X chromozom, nedostatečná tvorba NADPH → porušení NEDOSTATEČNÁ OXIDAČNÍ OCHRANA ERYTROCYTŮ VEDE K AKUTNÍM HEMOLYTICKÝM EPIZODÁM, VZÁCNĚJI KE CHRONICKÉ HEMOLÝZE DG: Heinzova tělíska – barvení briliant kresylovou modří Test autohemolýzy – zlepšení po glu i ATP Pozitivní methemoglobinový redukční test, mol-gen vyš. Screening: fluorescenční test – nedostatek redukované formy NADPH TH: vyvarovat se oxidačním vlivům

HEMOGLOBINOPATIE → vrozené, geneticky podmíněné poruchy primární poruchy hemoglobinových řetězců 1. THALASÉMIE /α,β/ 2. CHOROBY Z ABNORMÁLNÍCH HEMOGLOBINŮ Časté: HbS, HbC, HbD Punjab, HbE Vzácné: familiární Velká množství variant hemoglobinu, zvláště ty, které zasahují řetězce gama nebo delta, nemusí mít žádný klinický význam. Některé tyto hemoglobinopatie jsou však spojeny s hemolýzou, případně s polyglobulií a/nebo cyanózou

Talasémie BETA porucha syntézy β globinového řetězce, 11. chromozóm → precipitace nadbytečných α-řetězců – poškození membrány – hemolýza Erytropoéza je výrazně infefektivní, velká část erytrocytů zaniká ještě v kostní dřeni, současně je přítomná i periferní hemolýza se zkráceným přežívaním erytrocytů - výrazná kompenzatorní hyperplazii erytropoézy → uzurace kortikalis →deformity kostí, fraktury, extramedulární hemopoéza

Talasémie BETA u β0-talasemie tvorba řetězců zastavena úplně u β+-talasemie tvorba řetězců snížená Thalassemia minor /heterozygotní/ většinou klinicky němá, náhodný záchyt Hb kolem 100g/L, mikrocytární, mikrochromní hladina HbA2 je zvýšená na 3,5 až 8,0 %, HbF rovněž lehce zvýšena Thalassemia major /mohozygotní nebo dvojitě heterozyg./ Těžký průběh. Jsou-li ery schopny syntetizovat γ řetězce – HbF se silnou afinitou ke kyslíku – těžká tkáňová hypoxie Výrazná kompenzatorní hyperplazie erytropoezy při současné zvýšené zásobě Fe z rozpadlých ery – rozvoj přetížení železem Typické změny na skeletu „hair-on-end“, facies thalassemica, splenomegalie, důsledky přetížení železem

Talasémie BETA Diagnostika Terapie Prevence KO: hypochromní mikrocytární anémie, drepanocyty, bazofil.tečkování KD: výrazná hyperplazie erytropoezy Biochemie:↑ přímý i nepřímý bilirubin, ↑ Fe v séru, ↑ feritin v séru ELFO hemoglobinu: ↑ HbA2 ↑HbF Molekulárně genetické metody Terapie Transfuze erytrocytů, chelatační léčba Transplantace krvetvorných buněk Stimulace tvorby HbF /hydroxyurea, fenylbutyrát/ Prevence Vyšetření amniotické tekutiny DNA analýzou

Talasémie ALFA Tiché nosičství /silent carrier/ Alfa-thalassemia minor Tvorba α-řetězců kódována v diploidní erytroidní buňce 4 geny – 2 lokusy na každém z obou 16. chromozomů Tiché nosičství /silent carrier/ -α/αα Mikrocytóza, bez anémie Alfa-thalassemia minor --/αα Mikrocytóza, hypochromie, lehká anémie Choroba hemoglobinu H --/-α Anémie v 1.roce života, kostní změny Choroba hemoglobinu Barts αα/αα Hydrops fetalis

Hemoglobinopatie Abnormální hemoglobiny Nestabilní hemogloginy Srpkovitá anémie – HbS, HbC, HbD, HbE Nestabilní hemogloginy Kongenitální nesferocytární HA s tvorbou Heinzových tělísek Methemoglobinémie Stabilizace hemového Fe v trojmocné podobě Hemoglobiny se zvýšenou afinitou k O2 Polycytémie – tkáňová hypoxie s cyanozou

Hemoglobinopatie Abnormální Hb většinou vznikají záměnou 1 AMK zbytku v některém globinovém řetězci Diagnostika: ELFO Hb Identifikace abnormálního Hb tryptickým štěpením Testy tepelné stability /isopropanol/, tvorby Heinz. tělísek Testy na methemoglobin, vyšetření afinity k O2 Molekulární genetika Nestabilní hemoglobiny Hb Olomouc Hb Hradec Králové Hb Haná

Srpkovitá anémie Dědičná hemolytická anémie (β6Glu → Val) Polymerizace HbS → srpkovitý tvar ery → vazo-okluzivní krize V některých částech Afriky až 45% nosičů Homozygotní formy – symptomatické Heterozygotní – asymptomatické – prevence Plasmodium falciparum Klinika: anémie, splenomegalie, venookluzivní krize, hand-foot syndrome, bolestivé krize, přihody CNS, acute chest syndrome HEMOLYTICKÉ KRIZE: aplastická forma, krize ze sekvestrace ve slezině Diagnostika: těžká anémie, normocyt., normochrom., ↑ RTC, někdy i leukocytóza, trombocytémie, anizocytóza, poikilocytóza, terčovité ery, Howell-Jollyho tělíska, v případě autosplenektomie i normoblasty Bohatá kostní dřeň, známky extravaskulární hemolýzy, snížená osmotická rezistence, zvýšená hodnota HbF

Srpkovitá anémie TERAPIE Prevence krizí sprkovatěním Zkouší se léky zvyšující hladinu HbF – např. hydroxyurea Perspektivně translantace KD Genetické poradenství

Paroxyzmální noční hemoglobinurie ZÍSKANÉ, NEMALIGNÍ KLONÁLNÍ onemocnění pluripotentní kmenové bunky s intravaskulární hemolýzou, hyperkoagulací a relativní dřenovou insuficiencí Somatická mutace PIG-A genu (porucha syntézy GPI kotvy nutné pro vazbu CD 59 a CD 55, kt.chrání buňky před účinkem komplementu- C3b a C8b) PIG –A gen se nachází na X chr., ale PNH se vyskytuje jak u mužů tak u žen.

Paroxyzmální noční hemoglobinurie intravaskulárni hemolýza erytrocytů granulocytopénie indukované C3b C8b trombocytopénie žilní trombózy – atypické lokalizace (C3b a C8b indukuje prokoagulační enzymatické komplexy na povrchu destiček) sideropénie (hemoglobinurie a hemosiderinurie) hemoglobinurie po spánku (ne po noci) nepravidelné hemolýzy vyvolané infekcí, menstruací, transfuzí, operací, vakcinací… těžká trombóza krvácivé symptomy (15%) infekční komplikace (vzácně)

Paroxyzmální noční hemoglobinurie KREVNÍ OBRAZ A LABORATORNÍ NÁLEZY: anémie, zvýšené retikulocyty, granulocytopénie, trombocytopénie, zvýšený volný Hb v plazmě, snížený haptoglobin, hemopexin, zvýšený nepřímý bilirubin, zvýšená LDH MOČ: hemoglobinurie, hemosiderinurie KOSTNÍ DŘEŇ: hypercelulární forma se zvýšenou erytropoézou hypocelulární až aplastické formy Hamův test Hartmanův test Průtoková cytometrie Gelová mikroaglutinace Molekulárně – genetické vyšetření Hemosiderin v moči

Paroxyzmální noční hemoglobinurie KURATIVNÍ allogenní transplantace KD (10-20% riziko spontánních remisí při protrahovaném průběhu) PŘI MASIVNÍ HEMOLÝZE kortikoidy (Prednison) transfuze ery masy (deleukotizované) U APLASTICKÉ FORMY imunosupresiva (cyklosporin) a ATG

Paroxyzmální noční hemoglobinurie Progrese do těžké aplastické anémie 20-30% aplastických anémii přechází v PNH Závažné trombozy 20% (u gravidních ve 40% letální) Akutní leukémie 5% Spontánní uzdravení 1/3 Medián přežití 10 až 15 let Příčinou úmrtí : 10% dřenový útlum nejčastěji trombózy

Paroxyzmální noční hemoglobinurie Blokátory aktivace komplementu – Eculizumab

Extrakorpuskulární HA IMUNITNÍ Alloprotilátky Autoprotilátky Akutní /intravaskulární/ Hemolytická reakce Pozdní postransfuzní Hemolytická onemocnění novorozence AIHA s tepelnými protilátkami AIHA s chladovými protilátkami Paroxyzmální chladová HA Poléková HA Symptomatická autoimunitní HA

Extrakorpuskulární HA NEIMUNITNÍ Z chemických příčin Z infekčních příčin Z fyzikálních příčin Mikroangiopatické HA

Mechanické a fyzikální vlivy Neimunitní získané HA Mechanické a fyzikální vlivy Vadná srdeční chlopeň, pochodová hemoglobinurie, mikroangiopatické hemolytické anémie, rozsáhlé popáleniny Metabolické příčiny Jaterní choroby, Hypofosfatémie, hereditární lipoproteinémie, povvýživa, nadbytek mědi, Wilsonova choroby Chemické látky oxidační činidla, hadí jedy Infekce přímá infekce erytrocytů: malárie aj. septikémie /Clostridium perfringens aj./, Leptospiry, Borelie

MAHA Příčina Klinický obraz Rozrušení integrity membrány erytrocytu mechanickou příčinou v průsvitu cévy, nejčastěji depozity fibrinu v místě poškození endotelu cévní stěny: vaskulitidy, akutní glomerulonefritis, po SCT, nádory, operace chlopní, AV malformace, léky – cyklosporin, tiklopidin, cévní protézy, hemangiomatosa → fragmentace krvinek – schistocyty- zvýšený zánik ve slezině, při masivní hemolýze – intravaskulární hemolýza při současné aktivaci koagulačního systému – DIC s tvorbou mikrotrombů v cirkulaci Klinický obraz Dán kombinací Coombs negativní hemolytické anémie, trombocyto-pénie a přítomnosti mikrotrombů (CNS, ledviny)

MAHA Laboratorní nález Léčba Anémie s retikulocytózou, schistocyty, akantocyty, sférocyty, trombocytopenie se známkami DIC, nález multimerů při elfo vWF při TTP, molekulárně genetické vyšetření u TTP. Zvýšen přímý i nepřímý bilirubin v séru, zvýšená LDH, proteinurie, Hb-urie, zvýšen volný Hb, Kr, Ur Léčba Léčba vyvolávající příčiny, u TTP/HUS plasmafaréza se substitucí čerstvou zmrazenou plasmou, kortikoidy, antikoagulancia, transfuse erytrocytů

AIHA Hemolytické stavy způsobené protilátkami namířenýmiproti vlastním erytrocytům organismu ZÁKLADNÍ MOMENT V PATOGENEZI AIHA Porucha kooperace mezi supresorickými a pomocnými T lymfocyty a B lymfocyty, jež se uplatňují v procesu imunitního dozoru dysregulace tohoto systému vede k nedostatečné supresi tvorby protilátek proti vlastním antigenům či paradoxně ke stimulaci jejich tvorby

SMÍŠENÉ CHLADOVÉ A TEPELNÉ PROTILÁTKY AIHA TEPELNÉ PROTILÁTKY - IDIOPATICKÁ - SEKUNDÁRNÍ /lymfoproliferace, jiné nádory, autoimunitní choroby, virové infekce, imunodeficience/ - HEMOLYTICKÁ ANÉMIE INDUKOVANÁ LÉKY CHLADOVÉ PROTILÁTKY - IDIOPATICKÁ - SEKUNDÁRNÍ /lymfoproliferace, viry, mykoplazmata, autoimunitní choroby/ paroxyzmální chladová hemoglobinurie /lues, spalničky aj./ SMÍŠENÉ CHLADOVÉ A TEPELNÉ PROTILÁTKY

ZÁKLADNÍ MOMENT V PATOGENEZI AIHA Porucha kooperace mezi supresorickými a pomocnými T lymfocyty a B lymfocyty, jež se uplatňují v procesu imunitního dozoru dysregulace tohoto systému vede k nedostatečné supresi tvorby protilátek proti vlastním antigenům či paradoxně ke stimulaci jejich tvorby

AIHA LABORATORNÍ NÁLEZ KO: makrocytární anémie s retikulocytózou Biochemie:↑ přímý i nepřímý bilirubin ↑ urobilinogen v moči Speciální vyšetření: přímý a nepřímý antiglobulinový test (Coombsův test) PRŮKAZ INTRAVASKULÁRNÍ HEMOLÝZY ↑ volný Hb v plasmě ↓ hladiny haptoglobinu a hemopexinu v séru, hemoglobinurie

PŘÍMÝ ANTIGLOBULINOVÝ TEST Proprané erytrocyty jsou inkubovány se zpravidla králičími protilátkmami proti lidským imunoglobulinům /IgG nebo IgM/ anebo proti C3d složce komplementu. Po centrifugaci je odečítána přítomnost aglutinace, ke které dochází jen v přítomnosti IgG či C3d na membránach testovaných erytrocytů

NEPŘÍMÝ ANTIGLOBULINOVÝ TEST Prokazující přítomnost autoprotilátek v séru pacienta. K erytrocytům známého antigenního složení je přidáno sérum pacienta a provedena inkubace při 37°C, teprve v dalším kroku testu jsou přídány protilátky proti lidskému imunoglobulinu a po centrifugaci je hodnocena aglutinace.

Tepelné protilátky IgG charakter – optimální vazba při 37°C Vychytávání erytrocytů s navázanou protilátkou makrofágy sleziny vazbou na Fc fragment s Fcγ receptorem makrofágů EXTRAVASKULÁRNÍ HEMOLÝZA Při vysokém titru protilátek – možnost aktivace komplementu INTRAVASKULÁRNÍ HEMOLÝZA

Chladové protilátky INTRAVASKULÁRNÍ HEMOLÝZA IgM charakter – optimální vazba při 4°C Vazba ne erytrocyt v chladnějších akrálních partiích s možností aktivace komplementu, aglutinace komplementu INTRAVASKULÁRNÍ HEMOLÝZA Při méně pevné vazbě dochází k uvolnění protilátek v oblastech s vyšší teplotou aniž došlo k lýze erytrocytů, vychytávání erytrocytů makrofágy sleziny vazbou s C3b složkou komplementu fixovanou na erytrocytech EXTRAVASKULÁRNÍ HEMOLÝZA IgM charakter – optimální vazba při 4°C

Sekundární AIHA s tepelnými protilátky AUTOIMUNITNÍ CHOROBY SLE, revmatoidní artritis, sklerodermie, UC, AFS HEMATOLOGICKÉ NÁDORY chronická lymfadenóza, maligní lymfomy, vzácné akutně leukémie JINÉ NÁDORY karcinomy, thymom, Kaposiho sarkom, teratomy INFEKCE EBV, HIV-1,2, HCV, vakcinace /difterie-pertuse-tetanus/ IMUNODEFICITNÍ STAVY Kongenitální a získané hypogamaglobulinenemie a dysgamaglobulinemie

Polékové hemolytické anémie Imunitní mechanismy polékové hemolýzy Tvorba imunitních komplexů Chinin, fenacetin, sulfonamidy, izioniazid, inzulin Adsorpce na povrch erytrocytu PNC, cefalosporiny, chlorpromazin Modifikace membrány cefalotin Neznámy Alfa-metyldopa, L-dopa

Polékové hemolytické anémie HA asociována s omeprazolem Am. J.Gastroenterology 1991, Marks DR Těžká Coomb´s pozitivní HA

Algoritmus terapie IgG HA PREDNISONE IV SPLENECTOMY IMMUNOGL. PLASMAFERESA ASSESS SEVERITY WATCH MINIMAL MARKED MODERATE PREDNISONE 60mg/d NO YES SPLENECTOMY REDUCE TO 20mg/d RESPONSE NO RESPONSE CYCLOPHOSPHAMIDE AZATHIOPRIN RITUXIMAB REDUCE TO 5-10mg/d

Literatura DĚKUJI ZO POZORNOST