Struktura a funkce buněčného jádra Mgr. Andrea Benedíková MUDr. Josef Srovnal Laboratoř experimentální medicíny DK LF UP a FN Olomouc

Cíle semináře Seznámit posluchače se strukturou buněčného jádra a chromozómů Popsat hlavní funkci buněčného jádra – replikace, transkripce Poukázat na možnosti léčebného ovlivnění procesů na úrovni buněčného jádra

Prokaryota vs. Eukaryota Přítomnost x nepřítomnost jádra = základ pro třídění všech živých organismů eu = opravdu, karyon = jádro pro = před

Buněčné jádro Jádro lidské buňky: 5-8 μm v průměru 10% objemu buňky DNA 3x109 bp (haploid) (1 milion stran textu) celková délka DNA 2 m 2 x 23 chromosomů (od matky a otce) 23 tisíc genů

Struktura jádra jaderný obal jaderné membrány jaderné póry filamenta jaderná matrix chromatin jadérko

Jaderný obal Prokaryota vs. eukaryota Proč obal? Ochrana DNA při aktivitě cytoskeletu

Jaderné póry složeny z proteinových podjednotek kanály naplněné vodou – malé molekuly rozpustné ve vodě větší molekuly – tzv. jaderný lokalizační signál

Intermediární filamenta Nukleoskelet - komplexní struktura analogická cytoskeletu složená z jaderná laminy a několika typů filament nutných pro průběh replikace DNA, vazbu chromatinu a integritu jádra pevnost v tahu fce = vydržet mechanický stres

Jaderná matrix Eukaryontní chromosom – chromatin = komplex DNA + proteinů Bakteriální chromosom – cirkulární molekula DNA Heterochromatin - trvale v kondenzovaném stavu Euchromatin - v interfázi dekondenzován, v mitóze kondenzován

Jadérko = nucleolus chromozomy s geny pro rRNA transkripce genů pro rRNA a tvorba ribozomálních podjednotek

Chromozomy Eukaryontní DNA je uspořádána do chromozomů. Chromozom - dlouhá lineární DNA sbalená pomocí proteinů do složitějších struktur umožňujících snadné rozbalení a sbalení, čili úžasnou archivaci a zároveň rychlé čtení (milion stran textu v každé buňce). Struktura chromozomu se mění během buněčného cyklu (M-fáze – kondenzovaný, neaktivní, interfáze – dekondenzován, aktivní, transkripce).

Chromozomy 2 kopie každého chromozomu = homologní chromozomy jediný nehomologní pár – pohlavní chromozomy samců (XY)

Struktura genu na chromozomu Regulační sekvence – vazba proteinů ovlivňujících transkripci Eukaryontní geny jsou přerušovány nekódujícími sekvencemi = introny Kódující sekvence = exony Intronové sekvence jsou z primárního RNA transkriptu vystřiženy (setřih RNA = RNA splicing). Vzniká molekula mRNA.

Struktura nukleozomu Nukleozom = základní jednotka kondenzace chromatinu Nukleozom tvořen jádrem z osmi histonových molekul obtočených DNA Nukleozomy spojeny spojníkovou DNA Každý nukleozom = 200 nukleotidových párů DNA Kolem jádra nukleozomu 2 neúplné otočky DNA = 146 nukleotidových párů

Histony Malé proteiny s vysokým obsahem kladně nabitých aminokyselin – vazba na negativně nabitou cukr-fosfátovou kostru DNA V jádře nukleozomu po dvou molekulách typy H2A, H2B, H3 a H4 Histonů je v buňce značné množství (kolem 60 milionů molekul od každého typu v jedné buňce) a jejich celková hmotnost je přibližně stejná jako DNA samotné

Nukleozomy Chromatin – 30 nm silné vlákno Dekondezace – nukleozomy („korálky na niti“) Nukleozom = nukleozomové jádro + sousední spojovací úsek DNA omotání DNA kolem nukleozomu – zkrácení molekuly DNA přibližně o 1/3 její původní délky

Kondenzace do 30-nm vlákna - histon H1 Globulární jádro histonu H1 drží sousední nukleozomy u sebe v pravidelně se opakujícím uspořádání

Úrovně kondenzace chromatinu Předpokládané stupně kondenzace DNA vedoucí až ke struktuře vysoce kondenzovaných mitotických chromozomů

Funkce buněčného jádra replikace DNA transkripce processing, splicing RNA tvorba a transport ribosomálních podjednotek transport mRNA do cytosolu

Replikace Replikace – v S-fázi buněčného cyklu (synthesis) Zdvojení nejenom DNA, ale i histonů a jaderných proteinů Na konci S-fáze (8hodin) – dvě kopie chromozomu spojené centromerou laboratorní využití – metoda PCR

Replikace Vlákna DNA komplementární – obě slouží jako templát Replikace – vznik dvou nových dvojšroubovic DNA, které jsou věrnými kopiemi mateřské molekuly

Specializované sekvence DNA zajišťující účinnou replikaci chromozomů Každý chromozom má mnoho počátků replikace, jednu centromeru a dvě telomery

Replikační počátky DNA za normálních podmínek velmi stabilní – vodíkové můstky narušení – teplota okolo 100 °C v buňce - iniciační proteiny speciální nukleotidové sekvence - rozpoznávány iniciačními proteiny a snadné oddělení řetězců (enzym DNA-helikáza) po navázání iniciačních proteinů na DNA a otevření dvojšroubovice se na replikační počátek váží proteiny spolupracující na syntéze nového vlákna

Replikační vidličky začátky replikace mají typický tvar Y – replikační vidličky - navázány proteiny replikačního aparátu – pohyb ve směru replikace, rozvíjení dvojšroubovice za současné syntézy nového řetězce

DNA-polymeráza nejdůležitější enzym replikačního aparátu připojena k DNA pomocí speciálního proteinu, během replikace zůstává navázána na DNA a pohybuje se podél ní polymerační aktivita (5´-3´) - katalyzuje připojování nukleotidů na 3´-konec rostoucího řetězce DNA nukleázová aktivita (3´-5´) – štěpení nukleových kyselin při opravě špatně navázaného nukleotidu (korektura) (1 chyba na 107 navázaných nukleotidů)

Okazakiho fragmenty syntéza DNA pouze ve směru 5´-3´ vedoucí a opožďující se řetězec Ve směru 3´-5´ prodlužována DNA diskontinuálně po krátkých úsecích = Okazakiho fragmenty

RNA jako primer pro syntézu DNA DNA-polymeráza schopna vázat nukleotid pouze na předchozí komplementární nukleotid (viz. korektura) Nutno enzym schopný spojit dva volné nukleotidy a začít syntetizovat nové vlákno podle jednořetězcové DNA Primáza – syntéza RNA = primer pro syntézu DNA – poskytne 3´-konec pro DNA-polymerázu RNA-primery nakonec odstraněny nukleázou a nahrazeny DNA pomocí DNA-polymerázy, úseky nakonec spojeny DNA-ligázou

Přehled enzymů účastnících se replikace DNA-helikáza – oddělování mateřských řetězců DNA Primáza – syntéza RNA jako primeru pro syntézu DNA DNA-polymeráza – syntéza DNA řetězce Nukleáza - štěpí primerovou RNA DNA-ligáza – spojení úseků DNA do jednoho řetězce

SSB-proteiny (Single-strand binding proteins) součást replikačního aparátu - proteiny vázající se na jednořetězcovou DNA a chránící ji (po rozpletení helikázou) před znovuspárováním

Svírací protein (Sliding clamp) Součást replikačního aparátu – pevně váže DNA-polymerázu na templát, na opožďujícím se řetězci ji navíc uvolňuje po dokončení syntézy každého Okazakiho fragmentu

Replikace

Transkripce = přepis krátkého úseku DNA do RNA – vzniká RNA komplementární k jednomu řetězci DNA v některých krocích podobná replikaci další krok = translace (překlad) RNA – syntéza proteinů – probíhá na ribozomech

Transkripce Začíná jako replikace rozvolněním dvojšroubovice DNA - 1 z řetězců slouží jako templát Oproti nově vznikající DNA však nezůstává RNA spojena s templátovou DNA – po přidání nukleotidu dochází k obnovení dvojšroubovicové struktury DNA a vytěsnění vlákna RNA

RNA-polymeráza přepis DNA do RNA opět 5´-3´ polymerační aktivita nemá 3´-5´ nukleázovou aktivitu – neschopna oprav – transkripce méně přesná než replikace (1 chyba na 104 přepsaných nukleotidů) – RNA není určena jako DNA k trvalému uchování genetické informace

Posttranskripční úpravy (RNA processing) Bakterie – DNA volně v cytoplazmě, zde i ribozomy Eukaryontní DNA – v jádře, transkripce probíhá v jádře – RNA poté transportována z jádra do cytoplazmy jadernými póry před opuštěním jádra - posttranskripční úpravy primárního transkriptu přidání čepičky polyadenylace - vystřiženy introny = sestřih RNA (RNA splicing)

Léčiva směřující do buněčného jádra Léčiva ovlivňující dělení buněk: Cytostatika, imunosupresiva, antivirotika Inhibice biosyntézy NK – analoga Poškození struktury a funkce NK – alkylace, interkalace, inhibice topoizomeráz Alterace mikrotubulárních proteinů

Inhibice biosyntézy NK - analoga Analoga: aktivována a inkorporována do NK – zástava replikace, transkripce, nesprávný kód Indikace: nejčastěji hematologické malignity Dělíme na: Analoga kyseliny listové Purinová analoga Pyrimidinová analoga

Poškození struktury a funkce NK Účinek: poškození struktury a funkce NK má za následek inhibici replikace a transkripce. Indikace: nejčastější cytostatika, solidní tumory Dělíme dle mechanismu poškození NK na: alkylace – kovalentní vazba interkalace – nekovalentní vazba inhibice topoizomeráz (topoizomerázy jsou nukleární enzymy důležité pro replikaci – riziko překroucení dvojšroubovice a vznik zlomů)

Alterace mikrotubulárního proteinu Mitotické jedy – alterace mikrotubulů poškodí funkci dělícího vřeténka – omezená migrace chromosomů při mitóze. Většina omezuje syntézu tubulinu. Polymerizace – v rovnováze s - depolymerizaci Inhibitory polymerizace – inhibice syntézy Inhibitory depolymerizace – inhibice rozpadu

Přednáška volně ke stažení na: www.lem.ocol.cz Molecular Biology of the Cell, Fourth Edition Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter 28/02/2002 1616 pages Úvod do molekulární biologie Stanislav Rosypal, 4. vydání, 2006 Přednáška volně ke stažení na: www.lem.ocol.cz

Děkuji za pozornost Mgr. Andrea Benedíková Laboratoř experimentální medicíny DK FN a LF UP Olomouc Tel: +420 585 853 225 Email: benedikova.andrea@seznam.cz www.lem.ocol.cz